文档介绍：第20章细胞基因分离判定和原位杂交
第一节细胞DNA、 RNA分离判定技术
一、培养细胞基因组DNA提取及判定
人和哺乳动物细胞基因组DNA分离通常是在有EDTA、 Sarkosye等一类去污剂存在下, 用蛋白酶K消化细胞, 随即用酚、 ***仿抽提, 经RNase处理和纯化来提取DNA, 可用于细胞凋亡中对所引发DNA断裂、凝胶电泳展现“梯形”条带试验, 在细胞凋亡章节中已介绍了相关DNA提取和凝胶电泳判定, 除此之外, 提取纯化DNA还可用于分析其结构, 序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。
(一)DNA提取方法:
(1)取单层细胞, 经无钙、镁PBS洗一次, %胰蛋白酶消化, 细胞悬液经PBS洗2次,弃上清, 取细胞沉淀。
(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL, , EDTA, 10mmol/L NaCL, 1%SDS)充足混匀, ～1g/L、 %, 混匀裂解蛋白呈糊状。
(3)50℃水浴2小时, 转入37℃水浴过夜, 次日加入等体积饱和酚, 轻轻颠倒混匀, 以预防DNA断裂, 约3分钟。
1r/min离心15分钟（室温）
(4)取水相, 再加入等体积酚/***仿(1:1),一样颠倒混匀, 去除蛋白质
1 r/min离心15分钟（室温）
(5)再反复步骤(4), 再用等体积酚/***仿(1:1)抽提一次
(6)取水相, 再加入等体积***仿, 去除酚及蛋白质, 颠倒混匀
1 r/min离心15分钟（室温）
(7)取水相, 加入2倍体积预冷无水乙醇, 沉淀DNA, 混匀-20℃放置1小时
1 r/min离心15分钟（室温）
(8)用70%乙醇洗涤一次, 按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。
(9)加入RNase A至终浓度100mg/L, 37℃水浴消化1小时, 消化污染RNA。
(10)、 %, 混匀, 50℃水浴2小时, 加入Nace至终浓度10mmol/L。
(11)用等体积饱和酚各抽提一次, 步骤同前。
(12)吸上清, 加入***仿/异戊醇(24:1), 按上法再抽一次。
(13)取水相, 加入2倍体积预冷无水乙醇, -20℃ 1小时。
(14)取沉淀用70%乙醇洗一次, 真空干燥10分钟后溶于少许TE中, 4℃贮存。
(二)DNA纯度检测及含量计算
DNA浓度用紫外分光光度计测定, 核酸光吸收值在波长260nm处, 蛋白质则在280nm, 分别测定后, 其OD260/, 说明DNA中仍残留较多蛋白质, 此时可用酚、 ***仿继续抽提纯化。 , 断裂严重, 已成为小分子, 所以操作应轻柔。
取少许DNA溶液, 经紫外线扫描, 吸收峰值在波长260nm处, 其纯度应为OD260/OD280=
OD260值为1溶液大约含50μg/mL DNA, 故DNA浓度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀释倍数。
DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体积(mL)
DNA分子量大小测定, 可用含溴化乙锭1%琼脂凝胶电泳法测定, 依据加入标准品片断电泳迁移距离计算样品片断分子量大小, 此技术还可用作分离基因组DNA, 深入进行Southern吸印分析。
二、培养细胞总RNA提取及判定
细胞中含有三类RNA即rRNA、 mRNA和tRNA, 其中mRNA传输蛋白质全部遗传信息是克隆表示功效性蛋白基因最好起源, 是蛋白质合成场所,有特殊意义,不一样细胞所表示某种蛋白mRNA种类和产量是不一样, 为了提升细胞转录mRNA种类和产量, 通常需加入诱导剂来对细胞进行刺激培养, 如抗原、病毒、 PHA、 ConA、 LPS等。
提取细胞总RNA方法, 常见强烈变性剂如盐酸胍溶液处理细胞, 我们在细胞凋亡bcl-2基因RT-PCR法基因克隆中介绍了异硫***酸胍一步法, 但不纯, 本文介绍用盐酸胍来裂解细胞可造成细胞结构破坏, 核蛋白二级结构破坏, 可利于提取总RNA, 也可从总RNA中提取
mRNA, 从而分析mRNA表示量, 建立cDNA文库, 和对mRNA调控和进行反义RNA研究。
变性液: 7mol/L盐酸胍, 25m mol/, %Sarkosye, β-巯基乙醇。
水平衡酚: 在饱和酚中加入等体积DEPC处理三蒸水(或新鲜无菌三蒸水)混匀后去除水相,