文档介绍：第 20章细胞基因分离鉴定和原位杂交第一节细胞 DNA 、 RNA 的分离鉴定技术一、培养细胞基因组 DNA 的提取及鉴定人和哺乳动物细胞基因组 DNA 的分离通常是在有 EDTA 、S arkosye 等一类去污剂存在下, 用蛋白酶 K 消化细胞, 随后用酚、***仿抽提,经 RN ase 处理和纯化来提取 DNA , 可用于细胞凋亡中对所引起 DNA 断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条带的实验, 在细胞凋亡章节中已介绍了有关 DNA 的提取和凝胶电泳鉴定, 除此之外, 提取纯化的 DNA 还可用于分析其结构, 序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。(一) DNA 提取方法: (1) 取单层细胞, 经无钙、镁 PBS 洗一次,用 % 胰蛋白酶消化, 细胞悬液经 PBS 洗2 次, 弃上清,取细胞沉淀。(2) 加入 2 ml 细胞裂解液( 10 mMT ris HCL ,p , mol/L EDTA , 10m mol/L N aCL , 1%SDS ) 充分混匀,加入蛋白酶 K 至终浓度为 ~1 g/L 、S arkosye 终浓度为 % ,混匀裂解蛋白呈糊状。(3) 50℃水浴 2 小时,转入 37℃水浴过夜,次日加入等体积的饱和酚,轻轻颠倒混匀, 以防止 DNA 断裂,约 3 分钟。 12000 r /min 离心 15 分钟(室温) (4) 取水相,再加入等体积酚/ ***仿(1:1 ), 同样颠倒混匀,去除蛋白质 12000 r /min 离心 15 分钟(室温) (5) 再重复步骤(4) ,再用等体积酚/ ***仿(1 :1) 抽提一次(6) 取水相,再加入等体积***仿,去除酚及蛋白质,颠倒混匀 12000 r /min 离心 15 分钟(室温) (7) 取水相,加入 2 倍体积的预冷无水乙醇,沉淀 DNA ,混匀-20 ℃放置 1 小时 12000 r /min 离心 15 分钟(室温) (8) 用 70% 乙醇洗涤一次,按上法离心将沉淀真空干燥 10 分钟。(9) 加入 RN ase A 至终浓度 100m g /L, 37℃水浴消化 1 小时,消化污染的 RNA 。( 10) 加入蛋白酶 K 至终浓度 / L、S arkosye 至终浓度 % , 混匀, 50℃水浴 2 小时, 加入 N ace 至终浓度 10 mmol/L 。(11) 用等体积饱和酚各抽提一次,步骤同前。( 12) 吸上清,加入***仿/ 异戊醇( 24 :1) ,按上法再抽一次。( 13) 取水相,加入 2 倍体积预冷无水乙醇, -20 ℃1 小时。( 14) 取沉淀用 70% 乙醇洗一次,真空干燥 10 分钟后溶于少量 TE 中, 4℃贮存。(二) DNA 纯度检测及含量计算 DNA 浓度用紫外分光光度计测定,核酸的光吸收值位于波长 260 nm 处,蛋白质则位于 280 nm ,分别测定后,其 OD260/OD280 的比值应大于 . 低于此值,说明 DNA 中仍残留较多的蛋白质, 此时可用酚、***仿继续抽提纯化。若比值大于 1 .9 表明 DNA 链破坏, 断裂严重, 已成为小分子,因此操作应轻柔。取少许 DNA 溶液,经紫外线扫描,吸收峰值位于波长 260 nm 处,其纯度应为 OD260/OD280=1 .8 OD260 值为 1 的溶液大约含 50μ g/m L DNA ,故 DNA 的浓度(μ g/m L) =OD260 值× 50mg/L × 稀释倍数。 DNA 总量(μ g) =DNA 浓度(μ g/m L)× 总体积(mL) DNA 分子量大小测定, 可用含溴化乙锭的 1% 琼脂凝胶电泳法测定, 根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小,此技术还可用作分离基因组 DNA ,进一步进行 S outhern 吸印分析。二、培养细胞总 RNA 的提取及鉴定细胞中含有三类 RNA 即r RNA 、m RNA 和t RNA ,其中 m RNA 传递蛋白质全部遗传信息是克隆表达功能性蛋白基因的最佳来源, 是蛋白质合成的场所, 有特殊意义, 不同的细胞所表达某种蛋白的 mRNA 的种类和产量是不同的, 为了提高细胞转录的 mRNA 的种类和产量, 通常需加入诱导剂来对细胞进行刺激培养,如抗原、病毒、 PHA 、 ConA 、 LPS 等。提取细胞总 RNA 的方法,常用强烈变性剂如盐酸胍溶液处理细胞,我们在细胞凋亡的 bcl-2 基因的 RT-PCR 法基因克隆中介绍了异硫***酸胍一步法,但不纯,本文介绍用盐酸胍来裂解细胞可导致细胞结构破坏,核蛋白二级结构破坏,可利于提取总 RNA ,也可从总 RNA 中提取 m RNA ,从而分析 m RNA 表达量,建立 c DNA