文档介绍：第二军医大学
硕士学位论文
DNA损伤修复相关蛋白表达与辐射剂量关系的研究——基于纳米
生物探针DNA损伤修复相关蛋白检测方法的建立
姓名:张庆芝
申请学位级别:硕士
专业:放射医学
指导教师:闵锐;樊春海
20100501
中文摘要准确快速测定人员吸收剂量在放射伤员的分类诊断和临床治疗、肿瘤患者的精准化和人性化放射治疗、放射生物学效应研究、特殊辐射环境人员健康危害评价等领域都有重要作用和意义,是当今放射医学和辐射防护学研究的一项重要内容。物理方法测定辐射场剂量和个体的吸收剂量直接而准确,具有权威性。但在未佩带个人剂量计和未安装现场剂量监测计等情况下,用物理方法检测剂量十分艰难,这不仅因为准确检测需要花大量时间重建辐射现场,更因为有时辐射现场根本无法模拟和重建。因此,在一些特殊或突发情况,用物理方法检测人员受照剂量很难做到。用生物分析的方法来评估人员受照剂量虽有许多优势,是未来发展的方向,但仍存在许多待解决的科学和技术问题,问题的关键在于如何筛选出敏感、特异能反映生物受照剂鼍的一系列生物指标,及在此基础上建立准确可靠、灵敏快速的分析方法技术。随着新理论、新方法和新技术的运用,一些在基因和蛋白水平具有发展潜力的新生物剂量标志物不断被发现和报道。以鞍孜4淼腄损伤修复相关蛋白的含量和活化程度的改变与辐射剂量间的量效关系就是目前研究的热点之一。是一种在感应和传递损伤信号、启动损伤薷粗衅鹱胖匾W饔玫牡鞍祝浠罨潭扔隓损伤程度存在依赖关系,当发生鹕耸保珹蛋白自身被磷酸化,同时激活并调节一系列与薷聪喙的蛋白,包括,琋琈珻,龋贾抡庑┲匾9δ艿鞍聚集在鹕撕投狭训牟课唬迪钟隓损伤部位的连接,使修复顺利进行。文献报道丈浜种蛹纯杉鸄蛋白的活化信号,丈浜小时仍可检测到较高强度的鞍谆罨ü庠H欢ゼ觳釧活化大都采用免疫荧光的方法直接对细胞内的蛋白进行染色分析,此方法虽直观,但需要通过大量细胞观察并对其荧光强度进行识别和统计才能对罨拷邪攵考觳猓庵址椒岩允迪侄苑浼亮康淖既房焖俣ň胺析,尤其是在低照射剂量范围蛋白活化信号较弱的场合。因此,针对鹊鞍准觳庠谏锛量计研究中的应用,需要一种能直接定量和灵敏特异的检测方法。生物传感器是近年来发展较第二二军氏大学硕士学位论文
研究内容研究步骤快的一种特异、灵敏的生物分子检测技术,纳米材料因其良好的生物相容性和独特的光学性质,已经在ǜ衅鞯攘煊虻玫焦惴河τ谩本研究以化学或生物修饰的纳米材料为载体,以醛基磁珠表面修饰的タ共痘裱分的乖ü,通过纳米生物探针实现信号放大输出,建立可对溶质中量级皉进行灵敏、特异检测的方法,实现对甘标蛋白的灵敏、特异检测。与传统方法比,这种检测方案有可能使受评估的剂量范围更低。由于不同探针设计实现检测的方法不同,各有利弊,本研究在对一系列纳米生物探针,如纳米金探针,荒擅捉鹨籋探针,摸索筛选的基础上寻找更简便易行、稳定可靠的检测策略一荒擅滋脊秸搿根据筛选探针的不同,主要研究内容分为三部分:一、基于荒擅捉秸氲姆椒ḿ靑贝鞍二、基于荒擅滋脊芤籋探针的方法检测鞍三、基于纳米金一秸氲腞方法一、,室温反应过夜,獗眨胄南吹尤サ粑唇岷戏从Φ牡鞍祝么⒋嬉%匦淀即为纳米探针。二、制备探针的验证在包被有鞍椎亩嗫寺】固宓娜┗胖樘逑抵屑尤胫票傅奶秸耄ü觳馓秸肷系亩抗和磁珠上的多抗是否发生特异性显色反应,验证探针表面两种蛋白连接的成败和生物活性。三、利用探针检测目标蛋白将タ寺】固寮尤氲饺┗胖橹校嫦路跤吹映ビ卫氲鞍祝尤敕獗液。从獗杖┗胖楸砻婵赡艽嬖诘目瞻谆钚晕坏恪7獗战崾螅琍.%洗涤次,加入乖芤褐恋鞍妆昙堑拇胖槿芤褐校鹕诵薷聪嗵斓鞍妆泶镉敕浼亮刻煜档难芯
本研究的初步结果:制备出擅捉鹨籇探针,纳米金一秸牒虸擅滋脊芤籋探针三种具有生初步结论:轻微振荡反应。洗涤次,然后各加入嗫寺】固澹虑嵛⒄竦捶应。洗涤次,加入制备好的探针溶液,略俅畏跤迪挚乖固宓免疫反应连接。结束后,洗涤次,加入含椅路跤色完全并稳定后,酶标仪测光吸收值,收集数据并分析。四、数据处理分析软件进行数据统计分析,@胦制作各图表。方法检测限的确定标准为将阴性对照均值阴性对照的标准偏差设为阅值,信号高于此值的浓度即为该方法的最低检测限。方法的特异性从实验组与阴性对照组信号差别的量级上体现。物活性的纳米生物探针,经比较分析纳米碳管生物探针基本能满足标准体系中对鞍滋匾臁灵敏和可重复性的检测。与检测蛋白的经典椒ê推渌锎ǜ衅魈秸爰际醣龋狙芯坎捎玫哪擅滋脊芴秸信号放大的检测策略,在未增加实验步骤的情况下,保留了生物传感器信号充分放大的