文档介绍：中国协和医科大学
博士学位论文
中国红豆杉紫杉醇生物合成相关基因的克隆和异源表达研究
姓名:涂珺
申请学位级别:博士
专业:生药学
指导教师:程克棣
20040501
摘要基转移酶基因的盗性吮泶镌靥澹诖蟪Ω司薪辛巳诤媳泶锖头侨诤行比对后,。紫杉醇属于紫杉烷二萜化合物,在临床上用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌等鲆陨喜煌峁沟淖仙纪槎苹衔铮仙纪榻峁固氐惚砻髯仙即忌锖铣过程中从形成紫杉烷骨架后需要经过一系列的氧合及酰基转移步骤,催化紫杉烷一系列氧合反应和酰基转移反应的酶分别是羟基化酶和酰基转移酶。为了深入了解紫杉烷的生物合成途径和探讨基因工程技术应用于紫杉醇生产的可能性,采用同源性为基础的椒ㄊ状未又泄於股糴目饪寺〉玫了一个新的中国红豆杉紫杉烯醇酰基转移酶序列。它长为,推导编码霭被—比对蛄惺荩颐强梢酝贫险飧鲂驴寺〉膃蛄编码的酰基转移酶与已鉴定的红豆杉属酰基转移酶属同一亚家族。构建了这个酰表达,探讨了两种表达的差异,初步优化了融合表达条件。采用镍离子亲和层析行了初步探索。本研究还采用目馍秆》椒ㄊ状未又泄於股糴目庵锌寺〉揭桓羟基化酶片段。这个包含了一个的开放读码框架,编码个氨基酸残基此外,我们从中国红豆杉基因组0逯惺状慰寺〉玫絋蜃篈。将片段构建到酵母表达载体上,转化酿酒酵母工程菌辛朔侨诤媳泶铮玫搅讼嘤Υ笮〉谋泶锏鞍条带,进行了差异显示光谱分析鉴定。另外本研究中首次克隆得到中国红豆杉紫杉烯腔覆糠只蛐蛄校=徊娇寺∪ǔせ虻於ɑ 本项研究采用·椒ù又泄於股糴目庵锌寺◆腔富颉首次克隆得到一个新的中国红豆杉羟基化酶序列。测序表明多种癌症,目订紫杉醇及其半合成原料仍然离不丌生物来源。现已知有区为:8柱纯化了融合蛋白.⒂枚嘀肿仙纪榈孜锖虲底物对酶活性鉴定进:T谑褂肈蚇狟,编码中田脚和医科大学博宦畚摘璧
密码子的简并性,结合植物对密码子的偏好性,根据血红素结合区保守氨基酸可以设计更多组的特异引物或简并引物进行甈反应,将可以克隆到更多的红豆本论文首次克隆了中国红豆杉鲇胱仙即蓟蜃仙纪楹铣上喙氐聂腔赣全长为,其中包含了一个完整的长为的开放读码框架,推断编码霭被:P蛄斜榷苑治稣飧鲂驴寺〉腡序列编码蛋白与其它已鉴定的红豆杉属羟基化酶在同一亚家族?悸堑酰基转移酶基因,龌蛭J状伪ǖ迹⒍韵嘤蚪辛艘煸幢泶铮=步应用代谢工程研究紫杉醇生物合成或催化合成提供生物学手段。杉羟基化酶基因。中国仇和医科大学博宦畚摘蛰
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第伦仙纪槔嗷衔锷锖铣赏揪堆芯拷综述前言要资源植物,从我国特有的药用植物中丌发新药的前景十分广阔。一些来源于植物,生长缓慢。由于紫杉醇在树皮中的含量只有万分之几,即使用较先进的工艺,提取缱仙即既孕枰旰於股际鞯氖髌,因而已经使红豆杉的野生资源遭到了严重破坏。资源不足成为制约紫杉醇临床应全方位的研究。紫杉烷二萜化合物有丰富的结构多样性,已鉴定的化合物超过种,但目前只有紫杉醇及其衍生物多烯紫杉醇瘤等其他疾病的治疗,对紫杉醇类药物的需求仍不断增长接从红豆杉树皮中提取的紫杉醇原料加工而成的药剂;第二类为半合成紫杉醇是仍然离不开生物来源,NA吮Vひ┪锏墓┯捅;の颐抢狄陨娴药用植物是中药材的主要组成部份ヒ陨,也是许多临床用药的重物的药物可以用有机合成方法实现工业化生产,但仍有一些药物由于结构复杂,具有多个手性中心,如用有机合成方法生产则收率相对较低而成本却很高,难以达到工业化生产规模,这些药物仍然需要依赖生物的来源,如果这些药物资源紧缺,则容易造成生态和资源的破坏,影响深远。抗癌药物紫杉醇,就是这样一个典型的例子。紫杉醇属于紫杉烷二萜化合物,在临床上用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种癌症,渥试粗参锖於股际枪乙患吨氐惚;ぶ用的主要因素,由此带动了全合成⑾赴嘌.,燃负被应用于临床。由于紫杉醇治疗的瘤谱不断扩大,还可用于白血病、卡波济氏肉.,D壳跋鄣淖仙即及丛侠丛床煌煞殖啥啵谝焕嗍侵从红豆杉嫩枝条或树叶等可再生资源中提取出一去乙酰巴卡亭甦,.经化学半合成来生产紫杉醇或多烯紫杉醇。由于紫杉醇的全合成未能产业化,至少在近期内,紫杉醇及其半合成原料..,牒铣,约盎蚬こ中国协和医科人学博Q宦畚第伦仙纪槔嗷ㄎ锷锾↗彝厩Q卞辰鴍隧,.,;海⑹
生里坠塑垦壁叁兰坚豪妓勘ぼ笙鉴丝堡墨些垒塑竺塑垒けん们敌堡堕生态环境,药用植物的资源保护和可持续发展战略已经成为需要重点考虑的问题,在诸多的解决方案中,生物技术方法被寄予厚望。生物技术方法特别是廿世纪七十年代以来植物细胞培养生产天然产物的研方法生产紫杉醇进行了不懈的努力,植物细胞培养及微生物培养方法生产紫杉