文档介绍：安徽医科大学
硕士学位论文
辅助病毒依赖型腺病毒载体转基因的体外表达效率
姓名:郑娴娴
申请学位级别:硕士
专业:免疫学
指导教师:何金生
20100501
安徽医科大学硕士学位论文
辅助病毒依赖型腺病毒载体转基因的体外表达效率
中文摘要
目的辅助病毒依赖型腺病毒载体(Helper-dependent adenoviral vector, HDAd)主
要用于基因治疗的研究,目前仅有两篇关于 HDAd 作为系统疫苗载体的研究报道,
与第一代腺病毒载体或复制缺陷型腺病毒载体(First generation adenoviral vector,
FGAd)相比,发现 HDAd 可引起机体产生针对转基因的更强的细胞免疫和体液免
疫反应。一般认为这种增强的免疫应答主要与 HDAd 能在体内高表达转基因及减
弱的载体反应有关,关于这两种载体体外转基因表达情况的研究较少。绿色荧光
蛋白(Green fluorescent protein,GFP)因其可在异源组织中稳定发出荧光、所产
生的荧光不需要任何物质的辅助、不影响宿主等特性得到了广泛应用,增强型绿
色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)是经过密码子优化及氨基
酸突变等一些列基因改造后获得的 GFP 突变体,发出的荧光比 GFP 更强、更易观
察,成为比 GFP 应用更广泛的报告基因。为比较这两种载体的体外表达效率,我
们构建了可表达 EGFP 的 HDAd(HDAd/EGFP)并完成大量制备、纯化和体外表
达鉴定;同时与可表达 EGFP 的 FGAd(FGAd/EGFP)进行了体外感染和转基因表
达效率的比较研究,为进一步的体内免疫效果和免疫保护作用研究奠定基础。
方法通过 PCR 获得带有 CMV 启动子、EGFP 开放读码框(Open reading frame,
ORF)和 SV40 多聚腺甘酸序列的 EGFP 表达盒,先后克隆至 HDAd 穿梭质粒 pSC11
及 HDAd 骨架质粒 pSC15B ,构建 pSC15B/EGFP 重组质粒。Pme Ⅰ消化
pSC15B/EGFP 获得线性化片段,经磷酸钙共沉淀法转染 293Cre4 细胞,16 h 后感
染辅助病毒 H14,收获 HDAd/EGFP 粗提液,随后以 HDAd/EGFP 粗提液及辅助病
毒连续共感染 293Cre4 细胞直至 HDAd/EGFP 达到复制极限。大量制备
HDAd/EGFP , CsCl 超速离心纯化,荧光显微镜和电镜下观察纯化后的
HDAd/EGFP。使用分光光度计法测定纯化的病毒颗粒数(virus particle, vp),分
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别用约 2000 vp/细胞的 HDAd/EGFP 和 FGAd/EGFP 感染 A549 细胞,通过相同时
间点流式细胞仪分析 EGFP 的表达情况。
结果成功构建可表达 EGFP 的 HDAd/EGFP 载体,通过与辅助病毒共感染 293Cre4
细胞及 CsCl 梯度法超速离心制备了大量纯化的 HDAd/EGFP。纯化后体外感染
293Cre4 细胞,荧光显微镜下观察到 EGFP 的表达;电镜观察可见典型的腺病毒颗
粒。以相同量的 FGAd/EGFP 和 HDAd/EGFP 分别体外感染 A549 细胞,流式细胞
仪检测 EGFP 的表达情况,结果显示 HDAd/EGFP 感染早期的 A549 细胞较
FGAd/EGFP 有更高的荧光表达率及更高的表达强度。
结论成功构建、纯化了可表达 EGFP 的 HDAd/EGFP 载体,体外实验显示 HDAd
载体具有转基因瞬时高表达的特性,与 FGAd 相比,我们认为 HDAd 是一种更有
价值的疫苗载体。
关键词辅助病毒依赖型腺病毒载体,复制缺陷型腺病毒载体,增强型绿色荧光蛋
白,转基因表达
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In vitro transgenic expression efficacy of a Helper-dependent
Adenoviral vector encoding Enhanced green fluorescent
protein
Abstract
Object: Helper-dependent adenoviral vector (HDAd) was mainly used in gene therapy
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