文档介绍：四川大学
博士学位论文
胶原蛋白酶的纯化及其基因的克隆与表达研究
姓名:杨光垚
申请学位级别:博士
专业:遗传学
指导教师:张义正
20040401
胶原蛋白酶的纯化及其基因的克隆与表达研究中文摘要博士生杨光矗指导教师张义正教授在医学研究中可用于治疗椎问盘突出症等,实验室研究中作为工具酶应用于细胞和器官的分离,基础研究中可应用于胶原结构的研究,工业开发中可应用于胶原分级降解以获得胶原多肽,具有重要的理论研究意义和应用研究价值。微生物和动物组织来源的胶原蛋白酶已经有广泛的研究,至少从不同细菌和真菌中获得余种胶原蛋白酶,但由于它们大多来源于致病菌株,目前能够商业化本实验从成都皮革厂等经常堆积废弃毛皮、皮革的场所采集土样,通过富集、初筛、牛皮消化试验和胶原蛋白酶活性测定等方法,获得株具有胶原蛋白酶活性的菌株。通过形态观察、生理生化特征分析及微生物鉴定仪鉴定,分别鉴定为铜绿假单胞菌突鹕穹⒐飧司对铜绿假单胞菌涸鞍酌阜⒔吞跫难芯勘砻鳎洳涸鞍酶最佳培养基为明胶ァ⒄崽%、酵母粉ァァ·ィ鹗紁.;鹕穹⒐飧司鶰产生胶原胶原蛋白酶侵改芙到馓烊环潜湫越涸囊焕嗝浮生产的胶原蛋白酶的菌株很少。专业遗传学。四川大学博士学位论文ァ·
度为,最适反应为。和可以抑制该酶活性,而、蛋白酶发酵培养基的研究表明,多种氮源、碳源和金属离子能强烈抑制胶原蛋白酶的产生,⒔鸵海ü胄某蛩滤层析和活性胶切割等步骤,纯化了铜绿假单胞菌胶原蛋白酶S氪炕前的粗酶液相比,,加入基乙醇的还原性电泳表明该胶原蛋白酶并非是单链蛋白质,而是分解为分子量酶学性质测定表明该酶最适为,最适反应温度为℃。和不能抑制胶原蛋白酶酶活,表明该胶原蛋白酶为一种金属蛋白酶。亚基┒说陌被嵝蛄校浣峁#现,该序列与来自铜绿假单脆菌株的弹性蛋白酶的┒税被嵝蛄型性。性质分析表明煌诘缘鞍酌福膊煌谝丫⑾值钠渌碳俚胞菌菌株来源的胶原蛋白酶,因此且恢中碌慕涸鞍酌浮通过离心除菌,硫酸铵分级沉淀,.阴离子交换层析,疏水层析和汗瞬阄龅却炕街杌竦没鹕穹⒐飧司涸鞍酌窹。与纯化前的粗酶液相比,,分子量为。该酶最适反应温%:蛋白胨。铵分级沉淀,.阳离子交换层析,痳,但回收率仅为分别为、和的植煌笮〉难腔猄琒蚐根据分子量大小计算,该胶原蛋白酶是由,和三种不同亚基以簂:谋壤钩伞能够完全抑制胶原蛋白酶拿富睿琍以及测定了纯化的已经报道的铜绿假单胞菌弹性蛋白酶是一种单体蛋白质,—狦—狝—狶—猅。同源性分析发全一致。ァ四川大学博士学位论文
襫和挥杏跋欤砻鱌也是一种金属蛋白酶。文献检索未见火神发光杆菌胶原蛋白酶研究的报道,因此,且恢中碌胶原蛋白酶。根据胶原蛋白酶猄腔鵑末端测序结果和同源性分析,设计了引物扩增出并克隆到亚基的全基因。测序结果显示,该片段全长,编码区全长,该片段是一个完整的基因,命名为基因。该基因编码的蛋白质序列包含有个氨基酸残基组成的信号肽和霾谢槌傻那半蛋白酶基因序列同源性%,推导成熟肽氨基酸序列完全相同。其转化子细胞经超声波破碎后,其上清液在明胶平板上可产生透明的水解圈:明胶甈允境鲇朐て诖笮碌幕钚源篠。电泳不能检测到特异表达的蛋白质带,表明该基因表达量低;胶原蛋白酶活性测定显示,表达关键词:胶原;铜绿假单胞菌;火神发光杆菌;胶原蛋白酶;菌株筛选:序列。同源性分析表明,该基因序列与已经报道的铜绿假单胞菌菌株弹性将含有全基因的重组质粒转化大肠杆菌的没有胶原蛋白酶活性。发酵条件;纯化:基因克隆;基因表达四川大学博士学位论文
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胶原蛋白酶产生菌的筛选、鉴定及其发酵条件的研究第一章
摘要触掀鹗寂嘌涸鞍酌富钐岣呓ァ从成都皮革厂等经常堆积废弃毛皮、皮革的场所采集土样,通过以明胶为主要基质培养基进行富集和初筛,获得株有明胶酶活性菌株。招∑渲株明胶酶活性较高的菌株进行牛皮消化试验,有株菌能在谕耆牛皮。以退崛苄越涸5孜铮舛昃⒔团嘌褐薪涸鞍酌富性,确认这株菌都具有胶原蛋白酶酶活性,酶活力基本相同,约通过形态观察、生理生化特征分析及微生物鉴定仪鉴定,株菌可分为两类:昃M碳俚グ渲谢钚越细的一株命名为株菌为火神发光杆菌性较高的一株命名为菌液都能在谙Fぃ灾砥ひ灿辛己玫南Ч—分析显示牛皮消化后产生了大量非连续性的小分子多肽,提示菌液中存在的酶类对牛皮