文档介绍：南京师范大学
博士学位论文
吡啶衍生物的微生物羟基化及其酶的基因克隆与表达的研究
姓名:杨瑶
申请学位级别:博士
专业:微生物学
指导教师:袁生
20080530
,化学合成困难,而微生物转化的方法专一性强、条件温和且收率高,.吡啶双底物偶联生产新工艺,有效提高了吡啶衍生物的生产效率。同时,深入研究了两种不同来源的株煌孜锾匾煨前者能羟基化烟酸和杌拎ぃ笳呓瞿荇腔趟物特异性功能之间的关系。晔且恢昃哂星杌拎腔富钚缘木辏芯勘砻魉咕哂泻芨的烟酸羟基化酶的活性,是未报道过的具有烟酸羟基化酶活性的新菌种。该菌最适生长和产酶的碳源为テ咸烟恰⒌T次%蛋白胨、诱导物为パ趟帷4送猓它的发酵条件优越,在温度~℃、初始、装液量缎纹范围内产酶能力均保持很高水平,具有工业化生产应用的前景。研究了昃蚕⑾赴;:为、温度℃、。,反应越容易进行,该规律为其他吡啶衍生物的合成提供了思路。,在发酵过程中需要添加诱导物烟酸。随后发现菌株又能羟基化烟酸,并且诱导培养阶段的腔酸很少降解,遂开展了偶联生产这两种毗啶衍生物新工艺的研究。,通过向发酵液中回补烟酸的方法利用该菌株的疞的第二个产物羟基烟酸;.%保笛楸砻饔盏寂嘌锥位夭寡趟嶂,。本论文以吡啶衍生物烟酸和杌拎の5孜铮U了晡⑸雉腔难芯浚⒘,,不仅多获得了.
昃蚕⑾疞的产量。这种烟酸和杌にù呋新生产工艺将有效利用诱导物,并获得两个目的产物,节约成本,大大提高生产研究发现甓远嘀挚股鼐哂锌剐浴<畋湫苑ㄌ崛∠赴诘闹柿#测到一个约大小的质粒。用进行质粒消除实验,结果表明,质活性没有变化,推测烟酸脱氢酶的基因并不在质粒上。研究烟酸和腔趟岬淖贤馕展馄祝⒘,运用等吸收法进行比较,以确定消除畉痬ǘ确段谟辛己玫南咝怨叵担永什榷桑骄厥章为.%.%。,每天筛选量可达到~个反应,达到高通量筛选要求。应用该方法筛选昊蜃槲目猓秆个转化子,未获得含烟酸脱氢酶基因的阳性克隆。其他鼍盅趟嵬亚饷富蛐蛄校芯孔钤纾τ米疃嗟募俚グ戳衅渲校且未见该基因克隆与表达的研究报道。本实验室先前报道了一株的可以转化烟酸,但该菌株的基因组序列没有公布。与相似,、㈩獾鞍缀拖赴豤贙蜃樯霞焖鞯胶芏嘞嗨性高的功能域序列,但仅有一个基因簇猲,登陆号嗦的序列与报道中功能域排列顺序相同,推测为的蛋白,%。进一步开展基因克隆与功能表达基因簇,重组蛋白有烟酸脱氢酶活性,但不能羟基化磺杌拎ぃ蚯贸慕果进街っ髁薾就是甿谋嗦牖颍醚芯渴羌俚グ衾丛南京师范大学博士学位论文吡啶衍生物的微生物羟基化及其酶的研究疞,。粒消除后菌株对卡那霉素敏感,但仍对氨苄青霉素、安普霉素和链霉素具有抗性,推测质粒携带卡那霉素的抗性基因。同时,质粒消除后,暄趟嵬亚饷该双波长紫外分光光度法高通量筛选腔趟嶙;,选为参比波长。腔趟嵊搿鰽在~年发表文章首次公布了昙巴撇獾菌株能羟基化烟酸,但不能羟基化杌拎ぃ镁昊蜃樾蛄幸经公布。根据旰推渌滞撇獾腘墓δ苡蛐蛄.
白亚基的蛋白鞤两和Ⅳ口紸都能羟基化杌拎ぃ得髁薐Ⅶ的烟酸脱氢酶基因序列和功能表达的首次报道。?寺”,结合比对结果,分析皁和δ苡蚪峁共钜欤鞍关键词:烟酸;;;微生物转化;羟基化;南京师范大学博士学位论文吡啶衍生物的微生物羟基化及其酶的研究根据在内的好氧茵保守序列,设计简并引物扩增8玫鞍子牒醚跸妇鶱涞南嗨菩晕%,与厌氧细菌之间的相似性为%,与菌株的的相证明了烟酸和磺杌拎さ聂腔怯裳趟嵬亚饷复呋摹亚基置换结果显示:,。:烟酸脱氢酶;.
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