文档介绍：第二军医大学
博士学位论文
胰腺癌原发耐药性的比较蛋白质组学研究
姓名:刘清华
申请学位级别:博士
专业:病理学与病理生理学
指导教师:朱明华
2011-05
胰腺癌原发耐药性的比较蛋白质组学研究
摘要
胰腺癌原发耐药性的比较蛋白质组学研究
目的:观察体外健择、5-FU 初次作用后稳定状态残存人胰腺癌细胞的生物
学行为特点,并通过双向凝胶电泳技术及质谱技术的运用探讨残存癌细胞差异蛋
白质表达水平的变化,选择 3 种差异表达的蛋白质利用蛋白质印迹方法进行验
证。
方法:1、使用不同浓度的健择、5-FU 初次作用于四株人胰腺癌细胞 72 小
时后停药。实验组细胞停药继续培养,7 天后收集残存癌细胞,继续培养传代,
并进一步观察其生物学行为特点。通过体外 MTT 法测细胞生长曲线,流式细胞
仪检测细胞凋亡情况,Acumen 检测细胞周期分布情况,平板克隆实验检测残存
癌细胞继续传代后单个细胞体外增殖能力。体内裸鼠成瘤实验观察残存癌细胞继
续传代后裸鼠成瘤能力,成瘤后测肿瘤生长曲线,瘤体组织 HE 染色观察形态学
特点。2、利用双向凝胶电泳及质谱技术对残存癌细胞进行蛋白质水平的研究,
寻找差异表达的蛋白质。染色后的凝胶扫描后经 PDQUEST 软件分析,筛选出具
有明显差异的蛋白质点,切点采用 LC-MS/MS 的方法进行质谱分析。3、利用蛋
白质印迹方法验证蛋白质组学的结果。
结果:1、四株细胞停药后 7 天内仍见大量细胞继续死亡,至 7 天后各组残
存细胞继续死亡的数量减少,个别细胞开始增生,状态较稳定。部分残存细胞体
积增大,呈现不规则形状,胞浆内出现空泡;部分细胞呈小圆形;部分细胞呈长
梭形,细胞变得更加细长。继续培养,各株残存细胞 P0 代开始呈现克隆性增生
增生, BxPC-3-P0 代细胞增生时部分细胞胞浆内仍可见空泡。各株残存肿瘤细
胞继续传代培养,继续传代后的残存细胞形态和原细胞株细胞形态基本相似。四
株细胞使用不同浓度的健择和 5-FU 使各株残存癌细胞生存率均小于 15%。细胞
凋亡检测结果显示,各株细胞健择和 5-FU 停药 7 天后的残存癌细胞及继续传代
后的细胞存活率较高,细胞早期凋亡率较低。细胞周期结果显示残存癌细胞处在
G1 期细胞比例增加,继续传代后,处于 S 期和 G2/M 期的细胞比例增加,处于
G1 期的细胞比例减少。细胞生长曲线结果显示残存癌细胞处在平稳期增长不明
显,继续传代后的细胞在 5~7 天时增殖速度均有增快。平板克隆结果显示部分
细胞株残存的癌细胞传代后单个细胞增殖能力增强。体外裸鼠成瘤结果显示残存
细胞继续传代后瘤体生长速度和形态学观察均与原细胞株相似。2、双向凝胶电
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泳结果选取差异表达的蛋白质点 17 个,采用 LC-MS/MS 的方法进行质谱分析,
质谱分析出 20 个差异表达的蛋白质。3、选择其中的 3 种蛋白(Annexin A1,HSPB1
和 Serpin B5)利用蛋白质印迹方法进行验证,结果与双向凝胶电泳结果相符。
进一步利用蛋白质印迹方法检测体外裸鼠成瘤组织中 3 种蛋白的表达水平与其
在细胞中的表达水平相似。
结论:1、健择、5-FU 初次作用 72 小时,停药 7 天后的残存胰腺癌细胞状
态较稳定,可用于基因,蛋白等多种分子生物学水平的检测。稳定状态的残存人
胰腺癌细胞的生物学行为和原细胞株既具有差别又具有不同程度的相似性, 这
种差别表明对稳定状态的残存肿瘤细胞进行研究具有重要的意义,可以为进一步
了解肿瘤的原发耐药性提供基础。2、比较蛋白质组学检测出的 17 种差异表达的
蛋白质,涉及细胞信号转导、分子伴侣,细胞骨架蛋白及细胞代谢等方面。3、
蛋白质印迹方法对其中的 3 种蛋白(Annexin A1,HSPB1 和 Serpin B5)进行验
证,结果与双向凝胶电泳结果相符,表明 Annexin A1,HSPB1 和 Serpin B5 与胰
腺癌的原发耐药性有关。
关键词:
原发性耐药,健择,5-FU,残存肿瘤细胞,双向凝胶电泳,蛋白质组学
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胰腺癌原发耐药性的比较蛋白质组学研究
Abstract
Comparative Proteomic Approach to Intrinsic
Chemoresistance in Human Cell
Lines of Pancreatic cancer
Intrinsic chemores