文档介绍：华中科技大学
硕士学位论文
星型胶质细胞在不同接触状态下,CyclinA、CyclinD1与P27表达
研究
姓名:应天祥
申请学位级别:硕士
专业:人体解剖与组织胚胎学
指导教师:刘仁刚
2011-01
华中科技大学硕士学位论文

星型胶质细胞在不同接触状态下,CyclinA、
CyclinD1 与 P27 表达的研究

硕士研究生:应天祥
导师:刘仁刚教授
华中科技大学同济医学院人体解剖学系武汉 430030

中文摘要
接触抑制现象具有重要的生理意义,其与机体内器官,组织的形态、大小以
及各类细胞数量的控制有着密切的关系。机体的组织器官生长到一定程度后会自
然停止生长,而不是无限制的长大;在体外培养过程中,当细胞分裂增殖到一定
程度,达到相互接触时,细胞停止分裂。一般认为,接触抑制是由于细胞数量的
增加消耗了局部区域的促分裂因子;另一方面是细胞接触时自身分泌了一些细胞
增殖的抑制因子。2001 年 Nakatsuji Y [1]等人]的研究表明:星形胶质细胞的接触
抑制是通过介导细胞周期相关蛋白的表达而实现的,而细胞密度能够调控一系列
关键细胞周期蛋白水平的表达,可能是通过控制细胞周期的进程而实现。我们以
星形胶质细胞做为模型细胞,了解接触抑制的机理并探讨接触抑制与细胞周期调
控间的相互关系。
细胞周期调控是细胞的基本生理功能,其不仅控制细胞的分裂增殖,而且决
定着细胞的分化及死亡;同时,细胞周期调控对于细胞的许多重要生理功能亦有
至关重要的作用。因此,有理由相信,在细胞生长发育的整个阶段,都有可能在
细胞周期的调控下逐渐进展。细胞周期调节蛋白是一组功能各异、相互联系、相
互制约的核蛋白,按其对细胞周期的作用分为细胞周期正控蛋白(包括 Cyclin、
CDK 和 pRb)和细胞周期负控蛋白(CKI 家族)。细胞周期蛋白 Cyclin 作为一类
随细胞周期变化而循环出现和消失的蛋白质,它是从酵母到人类等真核生物中有
广泛作用的分子。Cyclin 在正常细胞周期调控中有重要作用。目前在哺乳动物细
胞中发现了 20 多种 Cyclin。对细胞周期有明确调控作用的主要是 CyclinA、B、
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C、D 和 E, Cyclin 分子在进化上有高度的保守性,其分子结构上都有一段“Cyclin
盒”序列,Cyclin 通过与 CDK 形成复合物发挥调控细胞周期或转录的功能;CDK
含量在细胞周期的各阶段相对恒定,其活性由于 Cyclin 的调节作用有所变化,
CDK 必须与相应的 Cyclin 结合,并且在一定部位发生磷酸化或去磷酸化才能有
活性或被灭活,Cyclin 及其相关分子是目前细胞周期调控研究中的热点。细胞周
期负控蛋白(CKI 家族)包括 P21,P27,P57 等,可抑制已知的大多数 Cyclin
-CDK 复合物的激酶活性,对 G1 期的早期与晚期、S 期等各期都有重要作用,
且分布与功能在不同的细胞各异,是目前的主要研究对象。
为了了解星形胶质细胞在接触抑制时相关的分子机制,我们选取三种细胞周
期相关蛋白 CyclinA、CyclinD1 和 P27 作为标志物,观察它们在星形胶质细胞增
殖和接触抑制过程中的表达情况,探讨接触抑制与细胞周期调控间的相互关系。
本研究在体外培养星形胶质细胞的条件下,检测其处于半汇合状态时,以及处于
汇合状态时 CyclinA、CyclinD1 与 P27 等三种蛋白的表达情况。将纯化的星形胶
质细胞进行传代培养,分别在其处于半汇合状态与汇合状态时进行下述实验。一、
采用免疫组化染色,将半汇合与汇合的细胞与上述三种蛋白的抗体反应,对结果
进行定性分析并行统计学分析。二、采用 RT-PCR 技术,分别于半汇合与汇合时
期检测上述三种蛋白 mRNA 的表达,将细胞裂解离心制成 RNA 样品,逆转录成
cDNA,产物扩增,对其进行跑胶,显影,并将结果进行统计学分析。免疫组化
结果显示:与半汇合时细胞相比,星形胶质细胞汇合时 CyclinA 表达显著下降
(p<),CyclinD1 表达显著下降(p<),而 P27 表达显著升高(p<);
RT-PCR 结果显示:与半汇合时细胞相比,星形胶质细胞在汇合时 CyclinA mRNA
表达显著下降(p<),CyclinD1 mRNA 表达显著下降(p<),而 P27 mRNA
表达显著升高(p<)。
结论:星形胶质细胞在体外培养情况下,细胞处于半汇合状态时,细胞周期
正向调节因子 CyclinA