文档介绍：广州医学院
硕士学位论文
产ESBLs和非产ESBLs肺炎克雷伯菌对喹诺酮类耐药机制差异的
研究
姓名:张宿荣
申请学位级别:硕士
专业:内科学
指导教师:叶晓光
2011-05
广州医学院硕士学位论文
产 ESBLs 和非产 ESBLs 肺炎克雷伯菌对喹诺酮类
耐药机制差异的研究

硕士研究生:张宿荣
导师:叶晓光教授
中文摘要
肺炎克雷伯菌作为医院感染病原菌检出率逐年增高,由于抗生素的广泛应用
甚至滥用,使其耐药率亦逐年增高。其中产 ESBLs 是 KPn重要的耐药机制之一,
同时产 ESBLs 较非产 ESBLs 菌株对其他几类抗生素耐药率高,而产 ESBLs 菌株
对其他类抗生素交叉耐药机制,目前国内外尚无系统的研究。
目的:
1. 建立产 ESBLs 和非产 ESBLs 肺炎克雷伯菌环丙沙星耐药模型,了解诱导耐
药菌对几类常见抗生素的耐药性特点。
2. 探明应用外排泵抑制剂后两组耐药菌外排泵阳性率的差异。
3. 探明两组诱导耐药菌诱导前后外膜蛋白表达差异。
4. 探讨两组诱导耐药菌 gyrA 和 parC 基因碱基突变位点的差异。
方法:
1. 对收集的 KPn 临床菌株按要求进行筛选,分为三类:敏感株(20 株)、耐药
株(10 株)、产 ESBLs 敏感株(9 株)。用环丙沙星对敏感株组和产 ESBLs 敏感
株组菌株进行体外多步法诱导耐药。采用 CLSI(2009)推荐的纸片扩散法对敏
感株组诱导耐药菌株进行多种抗生素的药敏实验及ESBLs 初筛和表型确证试验。
2. 应用琼脂二倍稀释法测定两组诱导耐药菌对环丙沙星和左氧氟沙星的 MIC,
CP 前后两组诱导耐药菌和临床耐药菌对环丙沙星的
MIC 的差异,并计算出三组菌株外排泵阳性率。
3. 用 SDS-PAGE 电泳观察敏感株组和产 ESBLs 敏感株组诱导前后外膜蛋白
(OMP)表达差异,并于临床耐药株组对照。
4. 对诱导前后敏感株组和产 ESBLs 敏感株组菌株的 gyrA、parC 基因进行聚合
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酶链反应(PCR)扩增,扩增片段长度分别为 879bp、536bp,并对扩增产物进行测
序,测序结果用 clustalX 软件和 NCBI 的 BLAST 功能进行序列比对分析,明确
诱导前后 gyrA、parC 基因碱基突变情况。
结果:
株 KPn 敏感株组菌株有 17 株成功诱导为环丙沙星高度耐药株,3 株在诱
导过程中死亡,平均诱导时间为 ± 天。9 株 KPn产 ESBLs 敏感株组菌
株均成功诱导为环丙沙星高度耐药株,平均诱导时间为 ± 天。敏感株组
17 株诱导耐药株对头孢他定、氨曲南、亚胺培南的敏感率为 100%(17/17);阿米
卡星敏感率 %(15/17),有两株中介;四环素敏感率 %(9/17),耐药率
%(5/17),有三株中介;而对莫西沙星的耐药率为 100%(17/17);头孢西丁
耐药率 %(15/17),有两株中介。经 ESBLs 初筛和表型确证试验,17 株诱导
耐药株均为 ESBLs 阴性。
2. 17株敏感株组诱导耐药株对环丙沙星、左氧氟沙星的MIC 分别为=128µg/mL、
=32µg/mL,外排泵阳性率为 47%(8/17); 9 株产 ESBLs 敏感株组诱导耐药株对
环丙沙星、左氧氟沙星的 MIC 分别为=256µg/mL、=128µg/mL,外排泵阳性率为
0;临床耐药株组外排泵阳性率为 30%(3/10),三组耐药菌株外排泵阳性率有统
计学差异。
-PAGE 分析发现,KPn 敏感株组菌株诱导前后可出现 OMP 的表达减少或
缺失,依其位置判断可能为 OmpK35 或 OmpK36。而产 ESBLs 敏感株组诱导前
后 OMP 表达基本一致,未出现明显的表达减少或缺失。
4. 经 clustalX 软件和 NCBI 的 BLAST功能比对,gyrA 基因以 514 位碱基和 742
位碱基突变多见,parC 基因以 406 位碱基突变多见,其次为 694 位碱基。KPn
敏感株诱导前后碱基突变差异大,而产 ESBLs 敏感株诱导耐药前后基因未见明
显突变。
结论:
1. 长期低浓度抗生素选择压力易引起细菌耐药,已存在对一类或多类抗生素耐
药的耐药菌更易引起对其他类抗生素的耐药性。
2. 外排泵为肺炎克雷伯菌对喹诺酮类的一种耐药机制,产ESBLs不会增加KPn
的外排泵阳性率。
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3. 喹诺