文档介绍：PCR检测技术培训班教材
山东省畜牧兽医总站检验技术中心
二OO七年六月
PCR的概述 2
蓝耳病病原检测方法 15
高致病性蓝耳病病原检测方法 17
口蹄疫RT-PCR检测方法 19
猪瘟RT-PCR检测方法 21
禽流感病毒通用RT-PCR检测方法 23
禽流感病毒H5亚型RT-PCR检测方法 25
禽流感病毒H7亚型RT-PCR检测方法 27
禽流感病毒H9亚型RT-PCR检测方法 29
新城疫病毒RT-PCR检测方法 31
PCR的概述
PCR即聚合合酶链技术最早于1983由美国的Kary Mullis提出，并用于人基因遗传变异研究，成功地扩增了 B-珠蛋白DNA,实现了胎儿镰刀形红细胞贫血病的产前诊断。这一技术的提出可以说是分子生物学技术的伟大创举，人类从此开始大规模地进行基因研究，并取得丰硕成果，这一技术也由于其所做出的巨大贡献，提出者Kary Mullis荣获人类科学的最高奖项诺贝尔化学奖。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq酶)用于PCR,大大简化了 PCR的操作，并明显改变了扩增反应的特异性和扩增效率。随着Taq 酶的应用和自动扩增仪的诞生，PCR技术更为简便、快速和自动化，PCR的普及应用也随之迅速加快进程，20多年的时间PCR技术迅速渗透到生物科学工作者的各个领域，成为分子生物学技术实验中最基础的技术之一，也可以说是分子生物学实验技术的基石。
一、PCR的分子基础核酸
在了解PCR之前，我们先来认识一个PCR所依赖的分子理论基础。大家知道进行PCR 时，首先需要得到PCR扩增的模板，这里指的模板就是核酸，核酸是细胞内贮存和传递信息的分子，是由很多单核昔酸聚合形成的多聚核昔酸。核昔酸可被水解产生核昔和磷酸，核昔还可再进一步水解，产生戊糖和含氮碱基。
核甘酸中的糖有核糖和脱氧核糖两种。由核糖构成的核酸称为核糖核酸
(ribonucleic acid, RNA );由脱氧核糖构成的核酸称为脱氧核糖核酸
(deoxyribonucleic acid, DNA)。
核昔酸中的碱基均为含氮杂环化合物，它们分别属于嚓吟衍生物和囉唳衍生物。核昔酸中的嗥吟碱(purine)主要是鸟嗥吟(guanine, G)和腺嗥吟(adenine, A)，囉唳碱 (pyrimidine)主要是胞囉唳(cytosine, C)、尿囉唳(uracil, U)和胸腺囉唳(thymine, T)。 DNA和RNA都含有鸟嚓吟(G)、腺嚓吟⑷和胞囉唳(C);胸腺囉唳(T) 一般而言只存在于 DNA中，不存在于RNA中；而尿囉唳(U)只存在于RNA中，不存在于DNA中。
核甘酸中的磷酸基因可含1、2、3个，分别称为一磷酸，二磷酸和三磷酸核昔。要合成核酸，必须是三磷酸核昔。
核昔中戊糖的轻基与磷酸以磷酸酯键连接而成为核昔酸。核昔酸之间的连接方式是：一个核昔酸的5，位磷酸与下一位核昔酸的3，-0H形成3，, 5Z磷酸二酯键，构成不分支的线性大分子，其中磷酸基和戊糖基构成DNA链的骨架，可变部分是碱基排列顺序。核酸是有方向性的分子，即核昔酸的戊糖基的5Z位不再与其它核昔酸相连的5 '末端，以及核昔酸的戊糖基歹位不再连有其它核昔酸的3，末端。
核酸的合成遵循Watson-Crisk碱基互补配对原则,即严格按照G-C, A-T (U )互补配对，由一条DNA链(模板链)复制出的新链与模板链互补。核酸链的增长按5，- 3 '方向进行，每一次增长一个核昔酸，合成DNA以dNTP为底物，合成RNA则以NTP为底物。DNA的合成需要DNA聚合酶的催化才能实现。以DNA为模板合成RNA的过程称为 "转录"，相反以RNA为模板合成DNA的过程称为"反转录”，反转录过程需要反转录酶。
RNA nucteolkfe Bate CuraciO
0
■A核音叢
TA
C
Old
GC- —GC-^ b^—AT— ^xWTA-
^TA-—
■TA—X
"**C The two strands of the G
C parental double helix unwind,
A and each specifies a new daughter 一 T strand by base-pairing rules
Old、 /
AT —
TA—
New、
L-——
GC-
DNA双螺结构及合成
二、 PCR定义
PCR (polymerase chain reaction)即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。
三、 PC