文档介绍：现象
原因
解决
反影(白色条带,黑色背景)
1 HRP过高(背景较高)
至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1
显影后膜上条带处变为黄色
2 HRP过高(敏感性太高)
至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2
信号弱或无
3 HRP过高引起底物迅速耗竭
至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3
4 抗体-抗原系统敏感性过低
提高抗体浓度/蛋白上样量*注4
5 转膜不充分/过转
优化转膜条件*注5
6 HRP或底物活性降低
测试活性或选用敏感底物 *注6
高背景
7 HRP过高(背景较高)
至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7
8 封闭时间不足
延长封闭时间4度过夜最好*注8
9 抗体与封闭液有交叉
更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9
10 TBST洗脱不足
增加洗脱时间、次数、用量*注10
11 暴光时间过长
降低暴光时间*注11
12 抗原-抗体浓度过高
降低抗体浓度或蛋白上样量*注12
条带内无显影的白点
13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间)
精细操作*注13
14 膜平衡不均/油脂污染
按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14
15 膜与X光片间有气泡
显影前去除气泡*注15
非特异性条带
16 抗体交叉反应
至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16
17 SDS非特异性结合蛋白条带
使用无SDS转膜液*注17
散在小圆斑
18 封闭液有杂质颗粒
静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18
*注1 其具体问题有二：一是背景较高,，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。其分析和解决同上。
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因