westernblot详解及问题分析.ppt

文档介绍：蛋白质免疫印迹技术及蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析常见问题分析张绍进 Western Blot ?? Western Blot Western Blot 简介简介?? Western Blot Western Blot 一般流程一般流程?? Western Blot Western Blot 常见问题分析常见问题分析 Western Blot Western Blot 简介: ?印迹法( blotting )是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。?1975 年, Southern 建立了将 DNA 转移到硝酸纤维素膜( NC 膜)上,并利用 DNA - RNA 杂交检测特定的 DNA 片段的方法,称为 Southern 印迹法。?而后人们用类似的方法,对 RNA 和蛋白质进行印迹分析, 对 RNA 的印迹分析称为 Northern 印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western 印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为 Eastern 印迹法。 Western Blot Western Blot Western Blot 基本原理基本原理 Western Blot Western Blot Western Blot 优点优点?高分辨率的电泳技术?特异敏感的抗原-抗体反应?1-5ng 中等大小的靶蛋白 Western Blot Western Blot Western Blot 应用应用?目的蛋白的表达特性分析?目的蛋白与其它蛋白的互作?目的蛋白的组织定位?目的蛋白的表达量分析 Western Blot Western Blot Western Blot 流程流程?蛋白样品的制备? SDS-PAGE ?转膜?封闭?一抗杂交?二抗杂交?底物显色 Western Blot ??通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白??水溶液提取法水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂最常用的溶剂。。??有机溶剂提取法有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取, 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取, 包括乙醇、丙酮和丁醇等。包括乙醇、丙酮和丁醇等。??通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的提取蛋白样品的提取 Western Blot 蛋白样品的定量蛋白样品的定量??目前常用比色法测定样品蛋白的含量: 目前常用比色法测定样品蛋白的含量: Bradford Bradford 法(考马斯亮蓝法)、法(考马斯亮蓝法)、 Lowry Lowry 法( 法( Folin Folin - -酚试剂酚试剂法)、法)、 BCA BCA 法等。但各有优缺点,大家可以根据法等。但各有优缺点,大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作,测定样品浓度。明操作,测定样品浓度。??蛋白质浓度测定的各种方法汇总: 蛋白质浓度测定的各种方法汇总: http://bbs./thread-23639-1- http://bbs./thread-23639-1- Western Blot 蛋白样品的变性蛋白样品的变性?2× SDS-PAGE 上样缓冲液: ? DTT 可临用前以 1:4比例混合加入,亦可全部配好分装, -20 ℃冻存。?按 1:1 比例与蛋白质样品混合, 95 ~ 100 ℃加热 5~ 15min , 冰上冷却后再上样,上样量一般为 20-25 μl,总蛋白量 20 ~ 50 μg。 100ml 总体积 g 溴酚蓝 20 ml 甘油 4 g SDS 20 ml 1M DTT 10 ml 1M Tris-HCl() ① 100mM Tris-HCl() ② 200mM DTT ③ 4%SDS ④ % 溴酚兰⑤ 20% 甘油⑥ ddH 2O