文档介绍：广州医学院
硕士学位论文
左旋紫草素通过抑制蛋白酶体活性抗肿瘤作用的体内外研究
姓名:黄洪标
申请学位级别:硕士
专业:病理学与病理生理学
指导教师:刘金保
20100601
广州医学院硕士学位论文左旋紫草素通过抑制蛋白酶体活性抗肿瘤作用的体内外研究
左旋紫草素通过抑制蛋白酶体活性抗肿瘤作用的体内外研究

研究生:黄洪标
导师:刘金保教授

中文摘要
背景与目的
泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是细胞内主要的蛋白质
降解系统,介导了细胞内多种蛋白的降解,参与细胞重要生命过程的调节。蛋白酶
体本身已成为包括抗肿瘤在内多种疾病的重要靶点,因此寻找有效的蛋白酶体抑制
剂也随之成为众多学者研究的热点。我国具有丰富的中草药资源,从中药单体中筛
选具有抑制蛋白酶体活性的药物具有广阔前景。本实验室运用已建立的的蛋白酶体
抑制剂筛选平台,对中草药单体化合物进行粗筛,发现左旋紫草素在体外能明显抑
制蛋白酶体活性。本研究在实验室前期工作基础上拟进一步探讨左旋紫草素在不同
细胞系诱导细胞死亡及在体抗肿瘤作用与其抑制蛋白酶体功能之间的关系。
方法与结果
、左旋紫草素对稳定转染的 GFPu-HEK293 细胞内蛋白酶体的抑制作用
选用稳定转染 GFPu 的 HEK293 细胞为研究对象,加入不同剂量( 0-8µmol/L)
左旋紫草素作用 8 小时收集细胞,裂解细胞抽提总蛋白进行 western blot 蛋白测定。
SDS-PAGE 电泳根据已报道的方法进行。采用 ECL-plus 测定试剂及 KodaK 公司生
产的 X 曝光成像系统对实验结果进行采集。结果表明:反映 UPS 系统功能的内源
性蛋白 Ub、外源性蛋白 GFPu在不同浓度左旋紫草素作用下开始出现聚集,并呈浓
度依赖关系。
2、左旋紫草素诱导 P388 细胞死亡与其抑制细胞蛋白酶体活性关系的研究
采用小鼠白血病 P388 细胞为研究对象,加入不同浓度的左旋紫草素(0-
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广州医学院硕士学位论文左旋紫草素通过抑制蛋白酶体活性抗肿瘤作用的体内外研究
6µmol/L)作用 6 小时及相同剂量(2µmol/L)作用不同时间(0-12h)后,裂解细
胞抽提总蛋白测定细胞蛋白酶体活性,发现左旋紫草素能明显抑制 P388 细胞内蛋
白酶体活性,且呈浓度和时间依赖关系。同等条件下用 Annexin V-FITC 染色流式细
胞术检测细胞的死亡情况,发现左旋紫草素诱导 P388 细胞死亡呈浓度和时间依赖
关系。抽提总蛋白进行 western blot 检测内源性蛋白 Ub,凋亡相关蛋白 PARP,结果
显示左旋紫草素引起明显的泛素化蛋白聚集和 PARP 的切割存在浓度和时间依赖的
关系,且蛋白酶体抑制发生在细胞死亡之前。
3、左旋紫草素对腹水瘤小鼠生存时间的影响
实验选择腹水瘤昆明小鼠为研究对象,小鼠腹腔接种肿瘤细胞小时后
开始给予腹腔注射剂量为的左旋紫草素,每天一次,持续给药天,观察
小鼠生存时间,连续观察天。结果显示左旋紫草素能明显延长腹
水瘤小鼠生存时间,溶剂对照组在天内小鼠全部死亡,而给药组第天死亡一
只,其余小鼠都存活到实验结束( 天)。
、左旋紫草素对实体瘤小鼠抑瘤作用与其抑制蛋白酶体功能之间的关系
实验选择小鼠肝癌细胞 H22 实体瘤昆明小鼠为研究对象,小鼠左腋皮下接种肿
瘤细胞 24 小时后开始给予腹腔注射剂量为 4mg/kg 和 8mg/kg 的左旋紫草素,每天
一次,持续给药 7 天,第九天剥取肿瘤组织,称重,提取肿瘤组织总蛋白用 western
blot 检测反映 UPS 系统功能的内源性蛋白 Ub、Hsp70、IkBa、Bax、P27,同时中
性甲醛固定肿瘤组织用免疫组化法检测 P27,TUNEL 法检测肿瘤细胞凋亡情况。结
果显示 4mg/kg和 8mg/kg的左旋紫草素能明显抑制在体肿瘤生长,抑瘤率分别达到
%和 %,western blot 检测显示给药组肿瘤组织内反映 UPS 系统功能的 Ub、
Hsp70、IkBa、Bax、P27 都出现了聚集,免疫组化同样显示肿瘤组织内 P27 蛋白聚
集,凋亡细胞增加。
结论
、左旋紫草素能抑制细胞内蛋白酶体活性,引起内源性和外源性蛋白酶体底
物蛋白聚集。
、左旋紫草素在体抗肿瘤作用可能是其抑制蛋白酶体功能的结果。
关键词左旋紫草素蛋白酶体抑制剂肿瘤死亡
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广州医学院硕士学位论文左旋紫草素通过抑制蛋白酶体活性抗肿瘤作用的体内外研究
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