文档介绍：华中科技大学
博士学位论文
Ik6 基因在急性淋巴细胞白血病中的表达及其功能的初步研究
姓名:周芬
申请学位级别:博士
专业:儿科学
指导教师:金润铭
2011-05
华中科技大学博士学位论文
Ik6 基因在急性淋巴细胞白血病中的表达及其功能的初步研究
博士研究生周芬
博士生导师金润铭
华中科技大学同济医学院附属协和医院儿科
武汉 430022
摘要
急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是儿童恶性血液病中
最常见的疾病,由于化疗方案的不断完善,其治愈率目前已高达 80%左右,但仍有部
分患儿对化疗不敏感或复发,预后不佳。临床研究表明,复发不仅仅出现于高危组,
还会出现在低危或中危组的患儿中,这种现象无疑对当前的危险度分级标准提出了严
峻的挑战。因此,不断发掘新的预后因素、完善分级标准、给予患儿针对性的化疗对
提高 ALL 患儿的预后有重要意义。
Ik6(Ikaros isoform 6, Ik6)是 Ikaros 基因的一个显性负相亚型,由 Ikaros 基因
IKZF1(Ikaros family zinc finger 1) 的外显子 3~6 缺失形成,是 IKZF1 缺失的主要
形式之一。Ik6 能够抑制 Ikaros 发挥正常的抑制血液系统肿瘤的功能,并且是 Ikaros
家族中最强的抑制因子。国外研究指出,Ik6 在 BCR/ABL 阳性的 ALL 中高频出现,
且与 ALL 预后不佳的临床因素密切相关,如原始细胞比例过高、异常细胞遗传学改
变、化疗不敏感、难以达到完全缓解等。Ik6 还参与细胞的凋亡途径,保护细胞免受
外界刺激导致的凋亡。据此,我们推测 Ik6 可能在急性淋巴细胞白血病的进展中起到
一定的作用。
慢病毒载体转染法是将外源基因转入悬浮细胞的首选方法,其转导效率高、基
因表达稳定持久且细胞毒性较低,其介导的基因过表达或沉默是研究基因功能的经典
方法。
本研究检测了 Ik6 在儿童 ALL 患儿骨髓细胞中的表达,并分析其与临床特征的
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关系;通过慢病毒介导的基因过表达,探索性研究了 Ik6 基因对 ALL 细胞株 Nalm-6
生长、侵袭及化疗敏感性的影响,旨在进一步认识 Ik6 基因在 ALL 中的作用与意义。
第一部分
Ik6 基因在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达及临床意义
目的: 探讨 IKZF1 及其显性负相基因 Ik6 在儿童急性淋巴细胞白血病患者中的
表达及其临床意义,以初步了解 Ik6 在 ALL 发生发展中的作用。
方法: 应用巢式 RT-PCR 方法检测 88 例初诊 ALL 患儿骨髓单个核细胞中 IKZF1
基因的表达情况;凝胶回收 DNA 产物片段并对目的基因测序鉴定;应用多重 RT-PCR
方法检测 ALL 融合基因的表达;分析 Ik6 基因的表达与患者临床特征的关系。
结果: 最常见的 IKZF1 亚型是 Ik2/3(%),其次是 Ik1(%)和 Ik4
(%)。急性 B 淋巴细胞白血病(B-ALL)和急性 T 淋巴细胞白血病(T-ALL)中
Ik6 基因的阳性表达率分别是 %(8/ 70)%(1/ 18)。在 8 例 Ik6 阳性表
达的 B-ALL 患者中,3 例 BCR/ABL 阳性,1 例 HOX11 阳性,4 例融合基因表达阴性,其
中 Ik6 的表达与 BCR/ABL 相关(P﹤)。分析 Ik6 与患者临床特征的关系发现,Ik6
与年龄、白细胞计数、危险度分级及其他遗传学特征无显著相关性(P>),但与
诱导化疗后的微小残留病(minimal residual disease, MRD)高水平相关(P﹤)。
结论: Ik6 在部分 ALL 患者中阳性表达,可作为临床预后评估的一项独立指标,
可能作为初诊时判断为高危白血病患儿的临床指标之一。
关键词: Ik6;急性淋巴细胞白血病(ALL);BCR/ABL;微小残留病(MRD)
第二部分
Ik6 过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定
目的: 构建含有人 Ik6 基因的慢病毒表达载体 pHR-CSIGW-Ik6,病毒包装后获
得由绿色荧光蛋白标记的病毒颗粒,转染 Nalm-6 细胞使之表达 Ik6 蛋白,为研究 Ik6
在白血病中的作用打下基础。
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方法: 通过 RT-PCR 方法从人急性淋巴细胞白血病细胞株 Sup-B15 获得 Ik6 基
因,