文档介绍：实训四细菌标本片的制备及染色法
目的要求能利用不同的材料进行细菌标本片的制备,会进行常规染色,并认识细菌的不同染色特性。
仪器及材料酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、细菌培养物(大肠杆菌、葡萄球菌等)、细菌病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等。
方法与步骤
(一)细菌标本片的制备
,抹片的方法亦有差异。
(1)固体培养物取洁净的玻片一张,把接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌后,取1~2环的无菌生理盐水,放于载玻片的中央,再将接种环灭菌,冷却后,从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许,与水混匀,作成直径1cm的涂面。接种环用后需灭菌。(实验视频二)
(2)液体培养物可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1~2环,在玻片上作直径1cm的涂面。
(3)液体病料(血液、渗出液、腹水等) 取一张边缘整齐的载玻片,用其一端醮取血液等液体材料少许,在另一张洁净的玻片上,以45°角均匀推成一薄层的涂面。
(4)组织病料以无菌剪刀、镊子剪取被检组织一小块,以其新鲜切面在玻片上做3~5个压印或涂抹成适当大小的一薄层。(实验视频三)
无论何种方法,切忌涂抹太厚,否则不利于染色和观察。
,必要时将涂面向上,置火焰高处微烤加热干燥。
。
(1)火焰固定是最常用的方法,将干燥好的抹片涂面向上,在火焰上来回通过数次(一般4~6次),以手背触及玻片微烫手为宜。
(2)化学固定有的血片、组织触片用姬姆萨染色时,要用甲醇固定3~5min。
固定的目的是使菌体蛋白质凝固,形态固定,易于着色,并且经固定的菌体牢固黏附在玻片上,水洗时不易冲掉。
(二)常用的细菌染色方法(视频三)
,滴加适量美蓝染色液覆盖涂面,染色2~3min,水洗,晾干或吸水纸轻压吸干镜检,结果,菌体呈蓝色。(实图4-1)
(视频二)
(1)在固定好的抹片上,滴加草酸铵结晶紫染色液,染1~3min,水洗。
(2)加革兰氏碘液媒染,作用1~2min,水洗。
(3)加95%酒精脱色约30s至1min,水洗。
(4)加稀释石炭酸复红或沙黄水溶液复染30s左右,水洗,吸干后镜检。
结果:革兰氏阳性菌呈蓝紫色,革兰氏阴性菌呈红色。(实图4-2、4-3)
,滴加瑞氏染色液于涂片上以固定标本,
1~3min后,再滴加与染色液等量的磷酸盐缓冲液或中性蒸馏水于玻片上,轻轻摇晃使与染色液混和均匀,5min左右水洗,干后镜检,菌体呈兰色,组织细胞的胞浆将呈红色,细胞核呈蓝色。
,用甲醇固定3~5min,干燥后在其上滴加足量染色液或将抹片浸入盛有染色液的染缸里,染色30min,或者染色数小时或24h,取出水洗,吸干或烘干,镜检。细菌呈蓝青色,组织细胞浆呈红色,细胞核呈蓝色。
附常用染色液的配制
甲液美蓝 ,95%酒精 30ml
乙液 %苛性钾溶液 100ml
将美蓝放入研钵中,徐徐加入酒精研磨均匀后即为甲液,