文档介绍：医学分子生物学
盛德乔
2017/11/11
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第十一章核酸的体外扩增
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第一节聚合酶链式反应
polymerase chain reaction PCR
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一、PCR的基本原理
PCR的基本原理
变性、复性、半保留复制
PCR三步曲
变性 90~97℃
退火 45~55℃
延伸 72℃左右
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二、PCR引物设计
一对引物,与3′端互补
长度:15~30个核苷酸
碱基分布随机
引物内、引物间不应有互补序列
引物与非特异扩增区无同源性
3′端必须互补
5′端可游离
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三、模板的制备
DNA
从细胞中提取DNA:血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞
固定和包埋的组织标本:脱蜡、蛋白酶K消化
RNA
新鲜组织或细胞
所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理
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四、PCR的基本反应
(一)、以DNA为模板的反应:
10×缓冲液 10 l 4种dNTP混合物各200 mol/L引物各10~100 pmol 模板DNA ~2 g Taq DNA聚合酶 u Mg2+ mmol/L加双或三蒸水至 100 l
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PCR反应五要素: 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
Taq DNA聚合酶
来自水生栖热菌 Thermusaquaticus
良好的耐热性
Mg2+依赖性
无校正功能
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(二)、以mRNA为模板的反应
mRNA 5 l
5× Buffer 4 l
dNTP 2 l(10mmol/L)
RNasin 1 l(20u)
AMV RTase 1 l(10u)
Oligo(dT)12—18(或下游引物) 1 l
ddH2O 6l /20 l
42℃水浴1小时,95 ℃水浴10分钟灭活逆转录酶。向上述反应体系中添加如下试剂:
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