文档介绍：第21章基因的细胞内导入技术
一、基本概念
•(一)基因导入(或基因转导):将外源性基因(或基因组
DNA) 导入细胞中的技术称为基因转导(gent
transfer)或称基因转移,也简称为导入。是研究基因
表达、结构和功能的重要研究手段。
•(二)基因转导的种类:
•1、染色体转导:(1)采用细胞融合(2)细胞显微
注射法将染色体片断导入细胞内。
•2、基因转导:(1)转基因技术(生殖细胞)(2)
基因转染(体细胞):磷酸钙法、脂质体介导法、电
击法(电穿孔技术)、DEAE葡聚糖法、细胞显微注射法
病毒载体介导法等。
二、物理、化学方法的转基因技术
1、用磷酸钙—DNA共沉淀法
•2、脂质体介导法
3、电击法(电穿孔技术)
•4、DEAE葡聚糖法
5、细胞显微注射法
•核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时,可使DNA
附在细胞表面,利于细胞吞入摄取,或通过细胞膜脂相
收缩时裂开的空隙进入细胞内,进入细胞的DNA仅有
1%~5%可以进入细胞核中,其中仅有不到1%的DNA可
以与细胞DNA整合,在细胞中进行稳定表达,基因转导
的频率大约为10-4,这项技术能用于任何DNA导入哺乳
类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于
贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。
)
•脂质体(lipofectin regeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-
[1-2,3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-
Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl
photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。
它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前
条件下最方便的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙
法,比它高5~100倍,能把DNA和RNA转染到各种细
胞。
)
•DEAE-葡聚糖介导的转染,其原理还不清楚,可能
是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核,此法
只适合暂时转染实验,转染效率与DEAE-葡聚糖浓
度以及细胞与DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的
长短很有关系,可采用较高浓度的DEAE-葡聚糖
(1g/L)作用较短时间(30分钟-),又可用较
低浓度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用较长时间(8小
时)
)
•本法需用特殊设置(电穿孔仪),把悬浮状态的
受体细胞和供体DNA共同放入皿中(或杯中),
再施以高压电脉冲,能够促进DNA通过细胞膜
而进入胞内,并可整合到细胞的DNA中,使细
胞发生转化。如转移的DNA为带有选择标记基
因的质粒,也可在选择培养基中进行鉴定
)
•本法是借助显微注射器直接把DNA注射入核内,使之
发生整合入受体细胞基因组中的技术。本技术需要有
严密无菌的净化室,以免敞开操作污染,同时要能有
自动拉针仪以制备显微针,一般用手动拉针器拉制时
,太长易折断,
针尖开口为2~3μm间,针口小于1μm更佳,针尖
开口大于5μm易刺伤细胞。
三、逆转录病毒载体介导DNA转染
•逆转录病毒载体属RNA病毒,先去除某些早期
基因,需在包装细胞中将目的基因与载体重组
体进行转录与复制,产生感染性假病毒,然后
感染宿主细胞后表达目的蛋白。