文档介绍：第22章流式细胞仪技术
•测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发
出的散射光和荧光,经染色的细胞在悬液中以
单行流过高强度光源的焦点,当每个细胞经过
焦点时,发出一束散射光/或荧光,经过过滤及
光镜系统收集到达一个光电检测器,光检测器
把散射光定量转化成电信号,经数字转换器进
行数字化后而成整数,以调出显示和进行分析
。
一、样品的制备
细胞必须做成单个细胞悬浮状态,细胞浓度
要保证在1-2×106/mL
二、悬浮细胞的固定
•:细胞悬液中加入等量的8%甲醛(用Hank‘S液
配)4℃下固定12-18小时或细胞悬于PBS中,缓
慢加入-20℃预冷的95%乙醇,使终浓度为70%
,冰浴30分钟或于细胞悬液中,缓慢加入冷
丙酮,使终浓度为85% 。
三、流式细胞仪检测方法
1、细胞的碘化丙锭(PI)染色
PI嵌入DNA双螺旋中,可使荧光强度增加约20倍,可用
于测定DNA的含量,细胞周期,细胞凋亡Ap峰
2、吖啶橙染色法(变色法)
吖啶橙染料可使细胞DNA和RNA着色,激发不同的荧
光,激发的波长为488nm,红色荧光为DNA,绿色荧
光为RNA或单链DNA(根据变色Æ细胞死活,分裂/
静止)
• 3、PI标记抗体检测:可用于检测癌基因异常表达
的蛋白,如:N-ras,Ki-ras和Ha-ras三种癌基因编
码的21Kd蛋白
• 4、以溴化脱氧尿嘧啶(BrdU)和Hoechst33258 染色
法: BrdU可在细胞合成DNA时代替胸腺嘧啶,染
料Hoechst33258荧光值在410~580nm之间,可以
检测细胞增殖周期
• 5、异硫氰酸荧光素(FIFC)染色法。
着色细胞在488nm下DNA呈红色荧光,蛋白质
呈绿色荧光。
• 6、荧光素标记抗体的应用
用荧光素标记一抗/或二抗测定膜表面蛋白或
用穿孔素进行膜穿孔后先加入一抗结合后漂洗
,再加入荧光素标记二抗,结合后在激发波作
用下发出荧光,测标记百分率或荧光强度,进
行统计分析。