文档介绍：华中科技大学
博士学位论文
HBV去甘露聚糖修饰逃逸树突状细胞DC-SIGN免疫识别的研究
姓名:邹小静
申请学位级别:博士
专业:内科学(感染病)
指导教师:田德英
2011-05
华中科技大学博士学位论文
HBV 去甘露聚糖修饰逃逸树突状细胞 DC-SIGN 免疫识
别的研究
华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科
博士研究生邹小静
指导教师田德英教授
中文摘要
目的:
研究 HBV 感染是否会引起宿主细胞 Golgi MⅠ活性升高,通过抑制 Golgi MⅠ介
导的 HBV 去甘露聚糖修饰,观察对 DC-SIGN 识别及 DC 成熟和功能的影响,来阐明
DC-SIGN 在 HBV 感染中介导的作用,并初步探讨 HBV 通过去甘露聚糖修饰逃逸
DC-SIGN 的识别,限制 DC 的活化的机制。
方法:
一. 研究 HBV 感染是否会引起宿主细胞 Golgi MⅠ活性升高
1. 培养 HepG2 细胞和 细胞,采用蔗糖密度梯度离心法分离纯化高尔基
复合体;
2. 比色法检测两种细胞高尔基复合体中 Golgi MⅠ的活性;
3. RT-PCR 法检测基因 MAN1A1、MAN1A2 和 MAN1C1 mRNA 的表达;
4. Western blot 检测上述 3 种基因编码的蛋白的表达情况。
二. DC-SIGN 在识别 HBV 并活化 DC 中介导作用的研究
1. 将不同终浓度的 Golgi MⅠ抑制剂——基夫碱加到 细胞的培养基中,
作用 24 小时后分离高尔基体,比色法检测 Golgi MⅠ的活性;
2. 在 细胞的培养基中加入终浓度为 5ug/ml 的基夫碱,持续处理 5 天后
收集其培养上清液,提取得到高甘露糖型 HBV 颗粒,采用荧光定量 PCR 的方法检测
HBV DNA 滴度;
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3. 分离健康人外周血单个核细胞,在体外 GM-CSF 和 IL-4 的作用下诱导分化成 DC,
光学显微镜和透射电镜观察细胞的形态特征;
4. 将前面得到的高甘露糖型 HBV 颗粒(5×106copies/ml),加入到培养至第 5 天的
DC 的培养基中,培养至第 7 天时,采用透射电镜观察细胞的形态结构,流式细胞仪
检测 DC 表面 CDla、CD80、CD83、CD86、HLA-DR 分子的表达,MTT 法检测 DC
刺激淋巴细胞增殖的能力,ELISA 法检测 DC 上清液中 IL-12 的水平。同时设加 PBS
组和加未经基夫碱处理的 细胞分泌的 HBV 组作为对照。
5. 将培养至第 5 天的 DC 预先经 DC-SIGN 特异性抗体阻断 2 小时,而后再分别加入
PBS 和上述两种类型的 HBV 干预,检测指标同前。
三. HBV 去甘露聚糖修饰逃逸 DC-SIGN 免疫识别的机制初探
1. 采用分子克隆的方法构建 HBV S、LS、MS、HBe、HBc、HBx 6 个功能蛋白的真
核表达载体,采用酶切及 DNA 测序的方法鉴定重组质粒;
2. 再将以上构建的 6 个质粒和 pEGFP-N1 质粒分别经 Lipofectamine2000 转染入
HepG2 细胞中,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,计算转染效率,比色法检测
细胞高尔基体内 Golgi MⅠ的活性;
3. 分别将 pEGFP-N1-HBe 质粒和 pEGFP-N1 质粒转染 HepG2 细胞,RT-PCR 检测转
染细胞 Golgi MⅠ3 种亚型的基因 MAN1A1、MAN1A2 和 MAN1C1 mRNA 的表达情
况,Western blot 检测相应的蛋白表达。
结果:
一. 研究 HBV 感染是否会引起宿主细胞 Golgi MⅠ活性升高
与 HepG2 细胞相比, 细胞 Golgi MⅠ的活性明显升高,MAN1A1、
MAN1A2 的 mRNA 水平显著上调,所编码的 MAN1A1、MAN1A2 蛋白量也显著增
加,而 MAN1C1 的 mRNA 和蛋白的表达量无明显变化。
二. DC-SIGN 在识别 HBV 并活化 DC 中介导作用的研究
1. 基夫碱在 细胞中可发挥对 GolgiMⅠ的抑制作用,5ug/ml 是合适的干
预浓度;
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2. 基夫碱干预的 细胞与未经基夫碱干预的 细胞分泌的 HBV
载量无显著差异