文档介绍：第三军医大学
博士学位论文
TLR4 信号通路在大鼠慢性应激心肌损伤中作用的研究
姓名:王荣平
申请学位级别:博士
专业:外科学(胸心外)
指导教师:肖颖彬
2011-05
第三军医大学博士学位论文
TLR4 信号通路在大鼠慢性应激心肌损伤
中作用的研究
摘要
一、研究背景和目的
应激为机体在各种内外环境因素及社会、心理因素刺激时所出现的全身性非特异性
适应反应。军事应激是指军人在完成军事任务过程中对极端恶劣生存环境、精神超负荷
紧张及超强度作业等在内的多种因素反应过程,包括心理、生理上的变化。适度应激反
应往往能活化思维、提高军人的警觉性和作业效率,但当应激压力导致军人的认知、情
绪和行为发生改变、严重降低作业效率时,则表现为军事应激障碍。
心脏是应激作用的主要靶器官之一。研究发现多种心脏疾病的发生和发展与应激机
制的激活密切相关,神经体液因素特别是炎症细胞因子的释放是重要机制。Toll 样受体
是一种膜受体,在机体防感染免疫中起关键作用,能被机体“危险”信号如:应激、损伤、
坏死等激活。在心脏中主要表达 TLR4。TLR4 激活使得信号转导到胞内,在一系列酶的
作用下,NF-κB 活化,转入细胞核中诱导特定基因的表达,导致炎症因子产生。
TLR4/NF-κB通路在慢性应激心脏中的作用还不清楚。为搞清上述问题,本课题
建立了大鼠慢性应激模型,观察慢性应激对心肌的影响,研究TLR4/NF-κB、IL-6、TNF-α
等和心肌损伤的关系,希望探索TLR4/NF-κB在慢性应激心脏中的作用,为慢性应激致
心肌损伤防治提供实验依据。
二、材料和方法:
第一部分:军事训练应激对战士心血管系统影响的观察
选取连队健康男性战士 64 人,年龄 18-20 岁,同时选取健康男战士 10 名做对照。
军事训练应激为 3 公里越野加 5 分钟数学运算,军事训练前后检测 BP、HR、EKG 和
SCL-90 量表,并于训练后抽血查血常规、C-RP、心肌酶谱、ACTH、皮质醇、TNF-α、
IL-6。对照组只抽血,不参加军事训练。
第二部分:大鼠慢性应激致心肌损伤及NAC防治作用研究
选用雄性 SD 大鼠,6-7 周龄,体重 180-220g,动物随机分为对照组和实验组,实验
组又分为应激 1d、1w、2w、3w、4w、NAC 组,每组 8 只。实验组采用每天束缚 6h+强迫
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游泳 15min 应激模式,NAC 组在应激同时每日给予 NAC150mg/kg 灌胃,持续 2 周。实
验期间每 3 天称 1 次体重,每天观察大鼠行为变化。
各组于试验结束次日处死大鼠。处死前连续记录 5 分钟心率、EKG 变化,记录血
压变化。分离血清,同时留取心尖部心肌标本做 TLR4 mRNA、NF-κB、电镜、病理和
心肌匀浆等检查。对照组不应激,和实验组大鼠同时处死取材。
心肌酶 CK 测定采用 ABC-ELISA 方法,LDH、AST 用全自动生化分析仪自动检测。
HE 染色观察病理形态变化,同时根据心肌出血、水肿和渗出情况对心肌损伤进行评分,
透射电镜观察心肌超微结构变化。采用 Tunel 法观察心肌细胞凋亡情况,用免疫组化方
法观察心肌组织 iNOS 表达。
第三部分:TLR4信号通路在慢性应激大鼠心肌表达和意义的研究
实验动物及分组同第二部分。用RT-PCR方法测定心肌TLR4mRNA表达,用EMSA
方法测定心肌NF-κB活性,用ELISA方法测定心肌匀浆TNF-α、IL-6含量,用免疫组化方
法观察心肌组织TNF-α、IL-6表达。
统计方法
所有数据均用平均数±标准差表示,样本均数比较用 t 检验,组间比较用单因素方
差分析,P < 认为有统计意义。
三、结果:
第一部分:
急性军事训练前后对比,应激后战士HR(次/分)增快(± vs ±,
P<),DBP(mmHg)(± ±, P<)升高。C-RP(mg/L)和对照
组比较升高(± vs ±,P<)。6名战士EKG表现为窦性心动过速,1名表
现为频发房性早搏、短阵二联律,1名表现为ST段抬高,其中V1导联>。SCL-90
量表9项分数每项和训练前比,均无显著性差异。训练后血浆ACTH、皮质醇、心肌酶谱、
HB、HCT、WBC、TNF-α、IL-6等和对照组相比,无显著性差异。
第二部分:
1、建立了“束缚