文档介绍：动植物细胞培养技术制药教学目的:掌握动物细胞培养基本技术;掌握植物细胞培养基本技术;了解动、植物培养生物反应器的类型;了解动植物细胞培养在生物制药领域中的应用。教学重点:细胞培养方式、基本操作(培养基的组成、制备、细胞培养过程的检测)计划学时:4第一节动物细胞培养技术及其应用一概述(了解)动物细胞体外培养具有明显的表达产物方面的优点,为传统的微生物发酵技术所无法替代。其中以它们转录后修饰和产物胞外分泌表达最为人们所感兴趣。大规模培养动物细胞生产生物制品大约始于本世纪50年代,Earle等开发出细胞培养基之后,主要是用于生产病毒疫苗。最初的生产方法是采用成百上千只体积小的培养瓶,后来又改用滚瓶培养。1967年,VanWezel开发了适合贴壁细胞生长的微载体,使得动物细胞的培养能够在搅拌釜式反应器中进行,大大提高了生产率。1972年,Knazek开发了中空纤维反应器,使得细胞密度大为提高。1975年,Koholor和Milstein创立了细胞融合技术,使得悬浮细胞的培养变得十分迫切,气升式反应器被应用于杂交瘤细胞的培养,以生产单克隆抗体。1978年,Lim还开发了细胞微囊化技术,将非贴壁依赖性细胞包含在较小的颗粒状微囊中,使培养在搅拌釜式或气升式反应器中进行,并放大至1000L规模。通过动物细胞培养大致可生产如下几类生物制品:(1)病毒疫苗如口蹄疫(FMD)、狂犬(Babies)、小儿麻痹症(Polio)、乙型肝炎(HbsAB)疫苗等。(2)非抗体免疫调节剂如干扰素(IFN)、白介素(IL)、集落刺激因子(CSF)、B细胞生长因子(BCGF)、T细胞替代因子(TRF)、迁移抑制因子(MIF)、巨噬细胞激活因子(MAF)。(3)多肽生长因子如神经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)。血清扩展因子(SF)、表皮生长因子(EGF)、纤维粘结素(Fibronnectin)。(4)酶如组织血纤维溶酶原激活剂(t-PA)、VII、Ⅷ因子等。(5)激素如红细胞生成素(EPO)、促黄体生成素(LH)、促培养滤泡素(FSH)等。(6)病毒杀虫剂如杆状病毒等。(7)肿瘤特异性抗原如癌胚抗原(CEA)等(8)单克隆抗体。(9)细胞本身。(10)皮肤重植。动物细胞技术需要进一步研究和开发的工作:(1)动物细胞基因工程技术和杂交技术。(2)新型细胞培养反应器及其培养技术。(3)无血清、低蛋白或无蛋白培养基。(4)新型微载体研制技术及微囊化技术。(5)产物分离纯化技术。二动物细胞培养的特性(1)细胞生长缓慢,易受微生物污染,培养时需要抗生素;(2)动物细胞较微生物大得多,无细胞壁,机械强度低,适应环境能力差;(3)培养过程需氧量少,且不耐受强力通风与搅拌;(4)在机体中,细胞相互粘连以集群形式存在,培养过程具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性及功能全能性;(5)培养过程产物分布于细胞内外,反应过程成本较高,但产品价格昂贵(6)大规模培养时,不可套用微生物反应的经验:(7)原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。三培养基的组成与制备(掌握)使动物细胞有可能在体外培养的基本条件之一,是提供尽可能与体内生活条件相接近的培养环境。这个培养环境包括10个因素:(1)温度,(2)渗透压,(3)氢离子浓度,(4)其他有机离子,(5)主要的代谢物,(6)补充的代谢物,(7)激素,(8)影响细胞代谢的其他因子,(9)细胞生长的基质(Matrix),(10)各因素间的相互作用。1氨基酸类必需氨基酸:体内不能合成而又是体外培养细胞所必需的-半胱氨酸和酪氨酸;非必需氨基酸:某些特殊细胞所需要,不能自制的,或易在培养过程中丢失的。氨基酸类的浓度与所需细胞浓度有关,氨基酸浓度与细胞生长密度间的平衡程度往往会影响细胞的存活和生长率。谷氨酰胺是多数细胞所需求的,作为能源和碳源被培养细胞利用;但有些细胞系则利用谷氨酸。2维生素类大多来自血清。减少培养液中血清含量,需要在培养液中增加维生素的种类和含量。3盐类主要包括Na+、K+、Mg2+,Ca2+,Cl-、SO42-、PO43-和HCO3-,是调节培养液渗透压的主要成分。4葡萄糖各种培养液中大多数都含有葡萄糖,作为提供能量的原料。5缓冲系统大多数平衡盐溶液采用磷酸盐缓冲系统。现广泛采用HEPES(N'-2-Hydroxyl-ethylpiperazine-N'-ethanesulfonicacid)作为缓冲系统,一般采用25mmol/LHEPES,起稳定和抵抗快速pH变化的,HCO3-是大多数培养细胞所必需的成分,但HCO3-的存在易引起培养液pH的明显改变。在培养液中加入HEPES时HCO3-的浓度范围可以大一些。培养液中的氨基酸由于浓度很低,缓冲效能甚微。如果提高培养液中的氨基酸浓度,则可提高缓冲作用。6矿物类细胞所需求的多种矿