文档介绍：第六节酶分子修饰与模拟
酶作为生物催化剂,其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的。因此,日益增多的酶制剂已用于食品发酵、疾病诊治和预防、环境保护和监测、化工产品的生产,以及基因工程等生物技术领域。
但是酶在实际应用中有局限性:
1、作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被
识别降解;
2、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验,
半衰期短、易变性失活;
3、酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产
工艺要求,限制了酶制剂的应用范围。
对策——酶分子工程 (MOLECULAR ENGINEERING OF THE ENZYME)
分子酶工程可以从分子水平改造酶,弥补天然酶的缺陷,并赋予它们某些新的机能和优良特性。随着各学科及相关技术的发展,特别是对酶结构与功能的深入了解、基因工程及固定化技术的普及,使酶分子工程已进入实用阶段。
总体来说酶的分子工程分两部分:一是分子生物学水平,即用基因工程方法对DNA或RNA进行分子改造,以获得化学结构更理想的酶蛋白;二是对天然酶分子进行改造(包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等)。
酶分子工程主要有以下几方面的内容
1)化学修饰(一级结构改造):对酶分子的侧链基团、
酶活性中心中的必需基团进行化学修饰,改造酶性能、
研究酶结构与功能的关系;
2)变性、诱导与构象重建(高级结构调整)
3)蛋白质工程(基因水平定位突变):用分子生物学方
法克隆酶或修饰基因以便产生新的酶(如突变酶),
或设计新基因合成自然界不存在的新酶(如抗体酶)
4)固定化酶:通过对酶分之内或分之间的交联,或与水
不容性载体的结合制成,催化特定的反应。
5)模拟酶:用化学方法合成新的有机催化剂,使其具有酶活性。
一、酶的化学修饰(一级结构水平的改造) (原理、方法、应用) 化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂和修饰条件,在保持酶活性的基础上,能够在较大范围内改变酶的性质,创造天然酶所不具备的优良特性,甚至创造出新的活性。 化学修饰方法虽多,但基本都是利用修饰剂所具有的各种化学基团特性,或直接或经过一定的活化过程,与酶分子上某氨基酸残基(一般尽量选酶活性非必需基团)产生化学反应,对酶分子结构进行改造。
1、化学修饰原理
凡通过化学基团的引入或除去而使酶蛋白共价结构发生改变(侧链基团的取代、肽链的限制性水解、分子内或分子间的交联),都可称为蛋白质的化学修饰。达到:
改造酶的作用特性(包括改变酶活性、专一性、对效应物响应性能及对辅助因子的要求)
提高酶的稳定性
扩大在体内应用可能性(防止在体内非专一性水解、减少和消除免疫原性以利于医疗应用)
用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶,使其溶血栓性提高了100倍
用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基,形成亲水性的α-NHCH2COOH后,该酶对60°C热处理的稳定性增高了1000倍。
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、L-谷氨酰胺酶、L-门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG修饰后,完全消除了酶的抗原性和免疫原性,减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度,酶的活力可以保存15%-45%。
2、化学修饰方法的几个问题
决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性,尽量少破坏必需基团,得到高的酶活力回收。为此,有时需要通过反复试验来确定。其中:
对酶性质的了解:活性部位、稳定条件、反应最佳条件及侧链基团性质等;
选择修饰剂考虑:1)分子量、修饰剂链长和对蛋白吸附性;2)修饰剂上反应基团的数目及位置;3)修饰剂上反应基团的活化方法和条件(一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团);
选择酶反应条件要注意:1)反应体系的溶剂性质、盐浓度、PH、温度、时间;2)酶与修饰剂的比例。
参考:酶工程
(1)、试剂的选择—要根据修饰目的选择
例如对氨基修饰可有几种情况——
修饰所有氨基而不修饰其它基团;
仅修饰-氨基;
修饰暴露的或反应性高的氨基;
修饰具有催化活性的氨基;
例:如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电状态或溶解性,则必须选择能引入最大电荷量的试剂。。。。(酶工程 P86)
用于修饰酶活性部位氨基酸残基的试剂应具备:
选择性地与一个氨基酸残基反应;
反应在酶蛋白不变性条件下进行;
所标记的残基在肽链中稳定以易于分离鉴定;
修饰反应的程度能简单测定;
最常用的修饰剂——PEG类修饰剂
聚乙二醇(polyethyleneglycol, PEG)通常没有免疫原性和毒性,不会破坏生物分子的活性,其生物相容性已通过美国食品和药物管理局(FDA)认证。特别是当酶经过PEG类修饰剂修饰后,修饰剂的许多优良性质也会在修饰