文档介绍：第二章  分子克隆工具酶
[本章摘要] 
    限制和修饰现象在上个世纪中期被人们所发现,到 2005 年 1 月,已经发现 4342 种限制酶和甲基化酶,其中限制酶有 3681 种。限制性内切酶有特定的识别位点和切割位点,切割后可产生平末端或粘性末端。酶切有标准的反应体系,受末端长度的影响,有位点偏爱性,在极端非标准条件下会产生星星活性。通过酶切连接可以增减酶切位点,酶切位点在基因组中的分布是不均匀的。大肠杆菌有三种甲基化酶和三种依赖于甲基化的限制系统。甲基化对限制酶切影响。基因操作常用的 DNA 聚合酶有大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ,T4、T7 DNA 聚合酶以及末端转移酶。为满足工作需要,还开发有 Klenow DNA 聚合酶,耐热 DNA 聚合酶以及反转录酶。除限制修饰酶和聚合酶以外,基因操作中还用到很多重要的酶,包括:连接酶、T4 多核苷酸激酶、碱性磷酸酶、核酸酶、琼脂糖酶、蛋白酶、溶菌酶以及一些 DNA 结合蛋白。
第一节限制性内切酶
一、限制与修饰(Restriction and modification)
    早在 50 年代初,有许多学者发现了限制与修饰现象,当时称作寄主控制的专一性(host controlled specificity)。 l 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性,其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题(表 2-1)。 l 在感染某一宿主后,再去感染其它宿主时会受到限制。
菌株
λ噬菌体感染率
lK
lB
lC
1
10-4
10-4
B
10-4
1
10-4
C
1
1
1
    说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统,可排除外来的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果,此时限制系统还未起作用。而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ,维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用,可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤,胞嘧啶 C 成为 5' 甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
    在 20 世纪 60 年代,人们就注意到 DNA 在感染宿主后会被降解的现象,从而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年,首次从 K 中分离到限制酶,它有特定的识别位点但没有特定的切割位点,其中切割位点离识别位点达 1000bp 以上。
    1970 年,美国约翰·霍布金斯大学的 H. Smith 于偶然中发现,流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)能迅速降解外源的噬菌体 DNA ,其细胞提取液可降解 DNA ,但不能降解自身 DNA ,从而找到 HindⅡ限制性内切酶。 HindⅡ限制性内切酶位点和切割位点如下:
            5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '
            3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '
    从此以后,发现的限制酶越来越多,并且许多已经在实践中得到应用。 EcoRⅠ是应用最广泛的限制性内切酶,酶切位点和切割位点如下:
            5' G↓AATTC 3'
            3' CTTAA↑G 5'
    限制性内切酶的命名遵循一定的原则,主要依据来源来定,涉及宿主的种名、菌株号或生物型。命名时,依次取宿主属名第一字母,种名头两个字母,菌株号,然后再加上序号(罗马字)。如 HindⅢ限制性内切酶, Hin 指来源于流感嗜血杆菌, d 表示来自菌株 Rd , Ⅲ表示序号。以前在限制性内切酶和修饰酶前加 R 或 M ,且菌株号和序号小写。但现在限制性内切酶名称中的 R 省略不写。
    1986 年下半年发现 615 种限制酶和 98 种甲基化酶; 1998 年发现 10000 种细菌或古细菌中存在 3000 种酶,且酶有 200 多种特异性。到 2005 年 1 月,共发现 4342 种限制酶和甲基化酶,其中限制酶有 3681 种,包括Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型限制酶各有 59 、3612 、10 种,甲基化指导的限制酶有 3 种,商业化的限制酶有 588 种,在Ⅱ型限制酶中共有 221 种特异性。
    根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子,限制与修饰系统至少可分为四类。表 2-2 是各种限制与修饰系统的比较。
    Ⅱ型(type Ⅱ)限制与修饰系统所占的比例最大,达 93% 。Ⅱ型酶相对来说最简单,它们识别回文对称序列,在回文序列