文档介绍：11 重组DNA技术
重组DNA技术是基因工程的核心技术
获得需要的目的基因(外源基因)
构建重组质粒和基因克隆
转化受体细胞和转化子的筛选
转化子的分析——Southern杂交
重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起,并很快产生了许多生命科学的高技术产业。
重组DNA技术,又称为基因或分子克隆技术,是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。
所谓基因工程(ic engineering)就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中,使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。
重组DNA技术是基因工程的核心技术
重组DNA操作一般步骤:
(1)获得目的基因;
(2)与克隆载体连接,形成新的重组DNA分子;
(3)用重组DNA分子转化受体细胞,并能在受体细胞中复制和遗传;
(4)对转化子筛选和鉴定;
(5)对获得外源基因的细胞或生物体通过培养,获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
获得需要的目的基因常用的方法:
(1)直接从生物体中提取总DNA,构建基因文库(gene library),从中调用目的基因;
(2)以mRNA为模板,反转录合成互补的DNA片段;
(3)利用聚合酶链式反应(PCR)特异性地扩增所需要的目的基因片段,等等。
获得需要的目的基因(外源基因)
细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建
细胞内总DNA的提取分离程序
紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。
基因文库的构建
将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上,便构成了该生物的基因文库。
反转录人工合成互补DNA
构建基因文库获取目的基因存在的问题——
费时费事
内含子序列
反转录人工合成互补DNA方法的优势——
获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因
聚合酶链式反应(PCR)
PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增(包括分离)一段目的基因的技术。
加入4种物质:
(1)作为模板的DNA序列;(2)与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补的DNA引物(20个左右碱基的短DNA单链);(3)TaqDNA聚合酶;(4)dNTP(dATP, dTTP, dGTP和dCTP)。
聚合酶链式反应(PCR)
变性、退火、延伸三步曲
变性:双链DNA解链成为单链DNA
退火:部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合
延伸:以目的基因为模板,合成互补的新DNA链