文档介绍：Folin-酚法测定蛋白质浓度
实验原理
Folin-酚试剂法包括两步反应:第一步是在碱性条件下,蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物;第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin试剂)还原,产生深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物),颜色深浅与蛋白质含量成正比。
此法操作简便,灵敏度比双缩脲法高100倍,定量范围为5~100μg蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起,因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外,不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。
试剂
试剂甲:
(A)称取10g Na2CO3,2g ,溶解后用蒸馏水定容至500mL。
(B) CuSO4·5H2O,溶解后用蒸馏水定容至100mL。
每次使用前将(A)液50份与(B)液1份,即为试剂甲,其有效期为1d,过期失效。
试剂乙:
(Na2WO4·2H2O)和700mL蒸馏水,再加50mL 85 %磷酸和100mL浓盐酸充分混匀,接上回流冷凝管,以小火回流10h。回流结束后,加入150g硫酸锂和50mL蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15min,驱除过量的溴,冷却后溶液呈黄色(倘若仍呈绿色,再滴加数滴液体溴,继续沸腾15min)。然后稀释至1L,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存,使用前大约加水1倍,使最终浓度相当于1mol/L。
操作步骤
标准曲线的制作
(1)配制标准牛血清白蛋白溶液:,倒入小烧杯内,用少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中,烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次,冲洗液一并倒入容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL,则配成250μg/mL的牛血清白蛋白溶液。
(2)标准牛血清白蛋白溶液的配制:取7支普通试管,按表加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水,配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。,混合后在室温下放置10min,,立即混合均匀(这一步速度要快,否则会使显色程度减弱??)。30min后,以不含蛋白质的1号试管为对照,用7200型分光光度计于640nm波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。
取7支试管,按下表操作
标准曲线
待测样品
1
2
3
4
5
6
7