文档介绍：第九章 重组 DNA 导入宿主
[本章摘要]
    重组 DNA 导入宿主有:转化、转导、转染、感染、结合等常见方法。转化现象于 1928 年被发现,现在有 CaCl2 转化法、原生质体转化法和电穿孔转化法三种常用转化法。转导由噬菌体介导,分为普遍性转导和局限性转导。转化、转导、转染、感染概念有部分交叉,注意区分。
一、转化
    1928, Grffith 在观察肺炎链球菌(us pneumoniae)有毒株和无毒株在活体内的相互作用时发现:把加热杀死的 S 型菌株和活的 R 型菌株混合培养时,能从中分离出活的 S 型菌,并能继续传代。看来在加热杀死的 S 型菌株中存在某种能使活的 R 型菌株转变成 S 型菌株的因子,他们把这种现象称为转化(transformation)。即来自一个细菌细胞(供体)的 DNA (片段)被另一个细胞(受体)所吸收(随后同受体染色体一起进行重组)。
     对 DNA 的吸收,仅在受体生长周期中的一个短暂阶段。能够吸收 DNA 的细胞,petent cell)。在转化中有功能的 DNA 是 ds 或 ssDNA, 线状或环状。感受态的确定似乎涉及某些胞内蛋白质的合成:肺炎链球菌产生的感受态因子能将感受态授于同一菌株的非感受态,而枯草芽胞杆菌的感受态因子似乎不能将感受态传给非感受态细胞。感受态因子可能是一种自溶酶,它能够产生或暴露结合 DNA 的受体位点。在肺炎链球菌和流感嗜血杆菌中,在最大感受态时期,群体中感受态细胞可达 100% 。
    在 中感受态细胞的比例似乎不超过 10-15%
(一)CaCl2 转化法
核心:目标细胞在 CaCl2·H2O 溶液中浸泡一段时间, 转化效率 107-109 cell/mgD 。
      N
: DH5a, TG1, XL-1Blue, JM105
   (1)冰上 30min
   (2)热激 42℃ 90"
   (3)恢复 1~2min
   (4)复苏 37℃ 45-60 min
(二)原生质体转化法 protoplast
适用于 G+ 细菌,特别是芽胞杆菌、酶母。
过程:
   (1)等渗环境下,脱细胞壁(Lysozyme) 
   
(2)细胞壁再生
(三)电转化法(electroporation)
缓冲液:10% 甘油或蔗糖,含(或不含) Mg2+ 离子。
转化条件: KV/ 25µF 200-400W。
二、转导(transduction)
   
由噬菌体将细菌基因由一个细菌(供体)转移到另一个细菌(受体)的过程。λ转导噬菌体的形成如图 9-1 所示。
(一)普遍性转导(generalized transduction)
    供体的单个或紧密连锁的少数几个基因被噬菌体因错误装配而转移给相应受体的现象称为普遍性转导。 phage 在供体中裂解中,部分供体 DNA 被包装,当感染受体菌时,若感染复数小于 1 时,缺陷 phage 可将供体 DNA 注入受体(此时原 phage DNA 不感染)形成新的表型。但这种表型不一定稳定,因为供体 DNA 不一定与受体发生重组,故此类转导称流产转导(
abortive transduction),p