文档介绍：实验二酵母菌大小的测定和细胞计数
一、实验目的
1、学会测微尺和血球计数板的使用方法。
2、建立对微生物大小的概念。
二、实验材料
1、显微镜、物镜测微尺、目镜测微尺、血球计数板、载玻片等。
2、麦芽汁培养基、酵母菌。
3、吸管、吸水纸等。
三、实验原理
(一)酵母菌大小的测定原理
所有微生物的大小需要用刻有一定刻度的测微尺来测量,先用绝对长度的物镜测微尺来校正不表示绝对长度的目镜测微尺,计算后者每格所代表的实际长度,然后放上待测的标本,用目镜测微尺测定标本上微生物细胞占目镜测微尺的格数,就可计算该微生物的大小。酵母菌的直径约8-10μm。
(二)酵母细胞计数原理
微生物常用的计数方法有两种,即直接计数法和间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接计数,能立即得到数值,但死活细胞都计数在内。后者是在乎板上长成菌落后再计数,反应较真实,但费时太长。本实验是利用血球计数板进行直接计数。计数前需对样品做适当稀释,按照规定方法及计算公式运算后,即可得出实际数值。
四、操作方法
(一)酵母菌大小测定的操作方法
(1)目镜测微尺的构造目镜测微尺是一块圆形玻片,其中央刻有精确的刻度,通常是将5mm划分为50格,实际每格等于100μm。刻度的大小是随使用的接目镜和接物镜的放大倍数而改变,用前必须用物镜测微尺来标定,如图。
(2)物镜测微尺的构造物镜测微尺为一块特制的载玻片,其中央有一小圆圈。圆圈内刻有分度,将长1mm的直线等分为100小格,每小格等于10μm,如图。
(1)取下接目镜,旋下目镜上的目透镜,将目镜测微尺放人接目镜的中隔板上,使有刻度的一面朝下,再旋上目透镜,并装入镜筒内。
(2)将物镜测微尺置于显微镜的载物台上,使有刻度的一面朝上,同观察标本一样,使具有刻度的小圆圈位于视野中央。
(3)先用低倍镜观察,对准焦距,待看清物镜测微尺的刻度后,转动目镜,使目镜测微尺的刻度与物镜测微尺的刻度相平行,并使两尺的左边第一条线相重合,再向右寻找两尺的另外一条重合线。如图
(4)记录二条重合线间的目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。
(1)目镜测微尺每格长度=两个重叠刻度间物镜测微尺格数×10/两个重叠刻度间目镜测微尺格数
(2)以同样方法,分别在不同倍率的物镜下测定测微尺上每格的实际长度。
目镜测微尺( )格=物镜测微尺( )格
目镜测微尺每格=( )
(3)如此测定后的目镜测微尺的尺度,仅适用于测定时所用的显微镜的目镜和物镜的放大倍数。若更换物镜、目镜的放大倍数时,必须再进行校正标定。
(1)取下物镜测微尺,换上酵母菌水浸制片。
(2)测量菌体的长度和宽度各占目镜测微尺几格,然后换算出菌体的实际长度。
(3)在同一标本上测定5-10个菌体,求其平均值。
(二)酵母细胞数的测定操作方法
血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台。中间的平台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面个刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格,其中只有中间的一个大方格为计数室,供微生物计数用。这一大方格的长和宽各为1m,深度为,。
计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格;另一种是大方格内分为25中格,每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造;它们都有一个共同的特点,即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成,见图。
(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数。
(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可。
(3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的厚玻片。
(4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内。
(5)计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按对角线位,取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数。如果规格为25格×16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。