文档介绍：第一军医大学
硕士学位论文
人大肠癌细胞转移相关的蛋白质组分析与鉴定
姓名:赵亮
申请学位级别:硕士
专业:病理学
指导教师:丁彦青
20060518
人大肠癌细胞转移相关的蛋白质组分析与鉴定硕士研究生:赵亮指导教师:丁彦青教授摘要硕士学位论文恶性肿瘤细胞的转移是导致患者死亡的主要原因,但迄今为止,对肿瘤转移机制的研究尚未获得突破性进展。筛选和鉴定在肿瘤转移中起重要作用的关键分子,寻找早期诊断的生物标志物和抗肿瘤转移的药物靶点,阐明肿瘤转移机制,是当前肿瘤转移的研究热点。肿瘤转移是一个多步骤、多基因参与的复杂过程,肿瘤转移的全过程受以下几个因素的调控:⒃谧R破舳跗贓—、超家族、选择素、整合素等参与肿瘤细胞间的脱落以及肿瘤细胞与胞外基质的粘附;⒅琢鱿赴蚣渲细胞分泌的蛋白水解酶及其抑制剂,在降解胞外基质和血管的基底膜过程中发挥重要作用;⒃谠硕蜃印⑸ひ蜃印⒐槌惨蜃拥鹊淖饔孟拢琢鱿赴ㄒ到转移靶器官;⒀9茉錾蜃覸、等促进新生血管的形成,伴随着肿瘤细胞的增生,形成新的转移灶,完成转移过程。鉴于目前对肿瘤转移机制的研究往往针对单个或少数几个分子以及关注基因水平的改变,缺乏系统性和综合性的分析,因此在所有这些调控因素中,究竟哪些分子在肿瘤转移中发挥关键作用,仍有待阐明。近年来开展的蛋白质组学技术为揭示肿瘤转移机制带来了新的希望。本研究以人大肠癌高、低转移细胞株为研究对象,采用比较蛋白质组技术鉴定了个与大肠癌转移相关的候选蛋白,并探讨了诖蟪Π┳R浦械淖用及其功能,具体研究结果如下:
⑷舜蟪Π┫赴档鞍字仕蚰旱缬炯际醯慕⒓捌溆呕优化人结肠癌细胞系的蛋白质样品制备方法,建立人结肠癌细点只在屑觳獾剑岷先砑治龊褪止ど秆。∪┓⑸⒄瓜喙氐鞍字实定基础。分别用磷酸盐缓冲液和等渗蔗糖溶液冲洗细胞,胰酶消化或直接刮刀法收集细胞后提取总蛋白质,利用固相梯度双向凝胶电泳技术进行分离,凝胶经银染显色后,用砑治计住=峁缘壬崽腔撼逡撼逑细胞并直接刮刀法所提取细胞总蛋白质进行双向电泳,可获得分辨率高、重复性好的人结肠癌细胞系图谱。等渗蔗糖溶液有效的降低了盐离子对等电聚焦的影响,聚焦效果优于磷酸盐缓冲溶液处理组;皿上直接刮刀收集的方法避免引入胰酶及其对细胞的破坏,保证了细胞蛋白质的完整性和代表性。我们实验表明以等渗蔗糖溶液冲洗细胞结合皿上直接裂解是一种较好的细胞蛋白质双向电泳样品制备方法,在此基础上我们初步建立了分辨率较高且重复性好的人结肠癌细胞系蛋白质双向凝胶电泳图谱。⑷舜蟪Π┫赴闟和牡鞍字首樗蚰旱缬痉治为了更好的理解大肠癌转移机理和寻找大肠癌预后的标志分子,我们运用双向凝胶电泳技术对人大肠癌高、低转移细胞株蚐细胞进行了差异表达双向凝胶电泳分析,数字化图像分析发现有个蛋白质斑点在两组凝胶中有显著差异表达,在赴斜泶锪可叩牡鞍字拾叩阌觯赴斜泶锪可叩牡鞍字拾叩阌觯欢ㄐ圆钜毂泶锓治表达量相差倍以上⑾龅鞍字拾叩憬鲈赟中出现,而有个蛋白质斑水平改变明显的蛋白质点作为质谱鉴定的靶点。⑺蚰旱缬静钜毂泶锏鞍字实闹势准ê脱橹以大肠癌高、低转移细胞株为研究对象,采用分离技术结合势准鲇氪蟪Π┳R葡喙氐牡鞍祝渲蠸细胞株表达上调的蛋白质有磷酸甘油酸变位酶字R掖及方岷系鞍缀透咔ㄒ坡首宓Ⅱ
性生长、运动、粘附、凋亡等过程,研究结果为阐明大肠癌转移机制及寻找预测硕士学位论文白,而热休克蛋白,膜联蛋白琢蛳佘樟姿峄福兴康鞍和表皮型脂肪酸结合蛋白在斜泶锵碌鳌4蠖嗍钜斓鞍坠δ苌婕爸琢鱿赴大肠癌转移的潜在标志物提供了理论依据。为保证蛋白质组技术鉴定结果的可靠性,在蛋白和水平对候选蛋白进行了进一步验证。采用和免疫细胞化学技术在蛋白质水平验证结果表明虲诘妥R频腟中高表达,且仅在检测到,蛋白质水平的验证结果与比较蛋白质组的分析结果完全一致。此外,采用半定量技术对编码候选蛋白的水平检测结果表明:编码蚉的在高转移的懈弑泶铮嗦際、和狥膍赟中高表达,所验证的编码候选蛋白的水平验证结果与候选蛋白的蛋白质组分析结果一致,说明候选蛋白在大肠癌细胞株中的蛋白水平变化主要是由于基因的转录水平高低不同所致,也肯定了候选蛋白在高、低转移株问的差异表达。结果表明通过蛋白质组技术筛选到的转移相关蛋白是可靠的。⑷刃菘说鞍氪蟪Π┳R频南喙匦苑治为更好的理解大肠癌细胞的转移机理和寻找可能的肿瘤预后标记分子标志物,我们用蛋白质组学方法对两种不同转移潜能的蚐细胞株的差异表达蛋白进行了研究,发现热休克蛋白在高转移潜能大肠癌细胞中的低表达。免疫细胞化学进一步验证和分析了该蛋白在蚐两种细胞中的差异表达和定位。例俅泊蟪Π┳橹瓯镜拿庖咦橹а芯糠⑾秩刃克蛋白的表达率与年龄、性别、组织学分级、┳R葡灾合喙’.。结果表明,大肠癌细胞热休克蛋白的过表达和肿瘤