文档介绍：中文摘要胞外蛋白酶长久以来一直被认为是杀线虫微生物侵染线虫过程中的一个重要毒性因子,这些酶大多属于丝氨酸蛋白酶家族的枯草蛋白酶类。研究表明,它们在促进微生物穿透线虫体壁屏障,侵入宿主体内等方面起着至关重要的作用。本论文从来源于杀线虫细菌侧孢短芽孢杆菌的一个侵染性丝氨酸蛋白酶入手,研究了细菌在侵染线虫过程中分泌的侵染性蛋白酶与线虫的保护屏障体壁粘液层蛋白之间的相互作用,试图阐释酶对线虫的降解及线虫本身的自我防护机制,为将来开发植物寄生线虫的生防策略提供新的思路和理论基础。已有的组织病理学和组织免疫学研究已表明侵染性丝氨酸蛋白酶是侧孢短芽孢杆菌侵染线虫过程中的一个重要病理因子。本研究首先构建了侧孢短芽孢杆菌基因缺失突变株进一步在分子水平上来验证侵染性蛋白酶的作用。将蛋白酶基因片段插入重组载体,成功得到整合载体缱;H氩噫叨萄挎吒司鶪惺芴玫ソ换煌粗刈榈脑砉菇基因突变株。结果表明缺失菌株奶灞诮到饽力和杀线虫活性同比野生菌株急剧下降。另外,,钡陌胫滤琅ǘ萀痬I胂晕⒓觳庀叱嬖诿感财忍跫碌目剐苑从峁砻鳎煌处理条件下线虫对蛋白酶的降解存在明显的抗性差异。活的线虫对蛋白酶的降解存在明显的抗性,而经过热杀死的线虫更容易被酶破坏和消解,这同先前组织免疫结果相一致,酶对线虫体表不同部位的结合能力不同,提取的线虫体壁和死的线虫更容易被酶攻击。结果证明线虫自身存在着一种有效的抗性机制可以抵抗酶对线虫体壁的攻击。先前曾有报道线虫体壁粘液层作为角质膜的最外层,在线虫防止外源病原侵害以及免疫逃逸机制方面起着非常重要的作用。因此,鉴定和分析侵染性蛋白酶在降解线虫体壁过程中相关的线虫体壁粘液层蛋白研究蛋白酶与线虫之间的相互作用,对于阐释酶对线虫的降解及线虫本身的自我防护机制具有极其重要的意义。本研究于是进一步通过对比和分析多种不同的蛋白提取沉淀方法,建立了一套适合线虫的样品制备技术,即采用%乙醇法提取蛋白,7ㄅㄋ醯鞍祝患八虻缬痉掷胩逑担河,
未知假设蛋白,共得到了龇直鹩敕烙庖摺⑻墙徒夤獭⑸锖铣伞⒛芰看~。在上述技术体系基础上,利用差异蛋白质组学方法,研究了蛋白酶胁迫下线虫的表达变化。经过仔细对比和分析,从凝胶共切取了个差异蛋白质斑点,经过质谱鉴定和数据检索得到匹配的蛋白质个。除去谢等途径有密切相关的蛋白质。进一步深入研究这些差异蛋白质将为阐明丝氨酸蛋白酶降解线虫体壁的分子机理提供理论依据。关键词:植物寄生线虫,侧孢短芽孢杆菌,生物防治,侵染性蛋白酶,基因敲除,抗性差异,线虫体壁粘液层蛋白,差异蛋白质组学,甌/甅质谱技术。福建师范大学黄薇硕十学位论文
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甒,福建师范火学黄薇硕士学位论文,甌/.甌琲甧,%.琲—.畉痬瓼疶..,,:珺,,,:狿甌痑,,.,。
中文文摘植物寄生线虫每年都给世界农业带来超过亿美元的损失,其危害已严重制约农业生产,成为世界农业生产中亟待解决的问题之一。目前,植物寄生性线虫病的防治多采用化学药剂。但是,由于植物病原线虫生活在土壤中,通常攻击植物的根部,使得化学防治的效果不太理想,且存在很多弊端,如化学杀线虫剂多为剧毒或高毒的农药,不易分解易残留,给环境带来严重的污染或破坏并直接对人类健康造成危害。因此,许多科学家都在努力寻找对环境无害的植物寄生线虫生物防治新途径,例如利用线虫的天敌微生物或其代谢产物来杀死线虫已成为当前研究的热点。长久以来,侧孢短芽孢杆菌一直被认为是一种能够抑制多种害虫的广谱生防细菌。本论文所用的研究材料侧孢短芽孢杆菌具有杀死松材线虫和腐生线虫的能力。近几年,有研究显示线虫的体壁和虫卵壁结构成分复杂,而保持线虫体壁的完整是线虫存活的关键。先前的研究结果也验证了上述观点,即的胞外水解酶侵染性丝氨酸蛋白酶能够降解线虫体壁,经组织病理学和组织免疫学分析也认为它是侧孢短芽孢杆菌侵染线虫过程中的一个重要病理因子。在上述研究的基础上,本论文的研究内容如下:紫冉徊酱臃肿铀窖芯亢脱橹ち瞬噫叨萄挎吒司妇秩拘缘鞍酌在细菌破坏线虫体壁和杀线虫过程中的作用。利用单交换同源重组的原理构建了整合载体绱┛椎姆椒ń玴转入侧孢短芽孢杆菌感受态后,筛选验证得到基因突变株6酝槐渲闓的体壁降解能力和杀线虫活性进行观察分析,发现其体壁降解能力以及杀线虫活性都要比野生型菌株急剧下降。得到的结果证实蛋白酶是降解线虫体壁促进侵染线虫的关键致病因子。芯苛讼叱嬖诿感财忍跫碌目剐苑从Γ峁砻鞑煌硖跫孪叱对蛋白酶的降解存在明显的抗性差异。利用阳离子交换层析以及疏水交换层析系统纯化了侧孢短芽孢杆菌的胞外丝氨酸蛋白酶。将分离得到的蛋白酶进行线虫毒性效应试验,,根据