文档介绍：第一军医大学
硕士学位论文
分子信标荧光定量PCR技术检测志贺菌ipaH基因的研究
姓名:赵丽华
申请学位级别:硕士
专业:病原生物学
指导教师:万成松
20060601
分子信标荧光定量际检测志贺菌基因的研究中文摘要目的:用分子信标荧光定量际跫觳庵竞鼐鷌颉方法:根据瞎ú嫉母J现竞鼐鶰阨蛐蛄校杓屏对引物和一条分子信标探针。选取曛竞鼐曜季昙按蟪Ω司⒊ρ咨趁啪金黄色葡萄球菌、链球菌,窒妇饕跣远哉眨兄竞鼐鷌蛱匾煨岳增:根据扩增结果及序列分析结果,选定福氏志贺菌株基因序列第一位核苷酸目标序列,进行特异性扩增,提取纯化产物;将纯化好的锪拥絧靥迳希玫絧重组克隆载体;扩增刈橹柿5木海蜕锛际豕静庑颍隚上公布的福氏志贺菌株基因进行核苷酸序列的比对:,并得到梯度浓度的—重组质粒;取不同浓度刈橹柿W髂0褰蠵及—择不同退火温度、浓度、探针浓度,最终得出优化后的—件;随后进行灵敏度分析、构建阳性标准品、通过拷贝数与值之间的线性关系,制定标准曲线;收集份未知临床腹泻患者粪便样本,进行分子信标荧光定量际跫觳庵竞鼐鷌颍Q橹な笛榈目煽啃裕辈捎糜ü庵盏惴ǘ份未知临床腹泻患者粪便样本进行荧光值测定。结果:本实验得出结果如下:鼐鷌虿捎肞蚉蕉砸铮直鸪晒┰出片断,电泳结果显示特异性好、灵敏度高。J现竞鼐鷌蚱系既朐靥寰螅庑蛑な涤隢基因序列的同源性为%。说明实验用重组质粒中含有基因钠希梢宰餮粜员曜计饭菇ㄑ粜阅0濉≡癫煌耐嘶鹞露取ǘ取⑻秸肱ǘ龋呕痳猼反应条件。臼笛橐詌谋妒盗邢∈捅曜计肺D0澹琍I舷掠我硕士学位论文菔笛樾枰#从μ
物,经ü舛坷┰鲆抢┰觯槊舳却锏./,经实验比较,比电泳法高个数量级。通过计算机将值与不同的浓度标准品的对数值作图,得出一条标准曲线,显示值和模板启始浓度的拷贝数之间具有较好的线性关系菸粗5牧俅哺剐夯颊叻啾阊居梅肿有疟關技术检测志贺菌基因,份临床腹泻患者粪便样本检测有荧光信号,判断结果为阳性,而其余萘俅哺剐夯颊叻啾阊疚抻ü庑藕牛捎糜ü庵盏惴ḿ觳萘俅哺剐夯颊叩姆啾阊荆峁觳饨峁恢拢橹ち朔肿有疟暧ü舛縋技术检测志贺菌基因的准确性及可靠性。结论:通过实验本研究发现:煨詉蚴荢嬖诘闹苯颖曛荆敫剐河泄兀遣痢疾有关病症的必要致病因子。肿有疟暧ü馓秸爰觳庵竞鼐鷌颍渫怀龅挠诺阍谟诩测过程中特异性结合明显高于其它常规核酸探针,敏感度高,定量检测下限的指标好。更有操作简单、快速、防污染等特点,是目前检测志贺菌的有效方法。捎胷猼陀ü庵盏惴ḿ觳軮临床腹泻患者的粪便样本,结果~致。验证了分子信标荧光定量际跫觳庵竞鼐基因的准确度及可靠性。肿有疟暧ü舛縋技术是一种全新的肿釉咏荒J剑集┰觥⒂ü馓秸朐咏弧⒂ü饧觳庖惶寤?梢淮涡约觳份样本跹粜远哉,适用于志贺菌食物中毒的快速诊断和大量样品的检测。对于大便和呕吐物样本,从样品处理到检测结果仅需。为食源性疾病的早期、准确的诊断提供了新的检测手段,可应用于志贺菌食物中毒快速诊断和食品微生物检测,有很好的应用前景和研究价值。【关键词】志贺菌分子信标.。判断结果为阴性。检测时间约。中文摘要—
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前言研究背景年代被确立为志贺菌属,分为四个种,群:痢疾痢疾志贺菌群⒏J现志贺菌是一类具有高度传染性、危害严重的革兰阴性肠道致病菌,由其临展中国家,并导致蚧颊咚劳觯ヒ陨衔岁以下儿童‘弧K孀沤昀泻病原菌对发现传染源控制疾病流行及有效地治疗细菌性痢疾均有重要意义。志贺菌可引起食物中毒。~年,国家食源性疾病监测网对北京、重庆、福建等个省、自治区、直辖市,共鲆谌丝诩嗖猓吃葱约膊”发事件起,患者人数人,微生物引起的食源性疾病事件和涉及的人数最多,%【浚鹣妇允澄镏卸净颊呤嘉;学物食物中毒患者数的冻啊?悸堑街⒆辞嵛淳驼锘蚵┍ǖ仍颍夜导适物中毒人数应在~万,年,而隐性感染的人可能更多。目前志贺菌的检测方法有:①通过志贺菌的形态结构及染色镜检等进行检测;②依靠血清学试验及生化反应检测,如虎刍蛩郊觳庵竞鼐由于当前科学技术的飞速发展,人类对生活质量提出了越来越高的要求,食品安全问题中病原生物的快速检测技术尤为重视。随着免疫学、生物化学、分子生物学、微生物基因组学的不断发展,传统的细菌分离、培养及生化反应,已远远不能满足志贺菌的快速诊断及其流行病学研究,对病原生物的鉴定已不再局限于形态学等检验上,还发展到从分子水平上检测核酸和蛋白质等生物大分子。近年来,新的细菌诊断技术和方法不断用于微生物的鉴别,发展了不少志贺菌最早由攴掷氩⒚盜。世纪贺菌群⒈现竞鼐和宋氏志贺菌群。床感染所导致的志贺菌性痢疾鞘澜缟希绕涫欠⒄怪泄抑匾的