文档介绍：几种食源性致病菌荧光定量觳夥椒ǖ慕课题来源:学位申请人答辩委员会成员病原生物学苏裕心郑学礼教授王景林研究员余新炳教授吴忠道教授李华教授陈晓光教授江钢锋教授论文评阅人詹希美教授张玲敏教授月广州业南方医科大学级硕士学位论文—
几种食源性致病菌荧光定量觳方法的建立硕士研究生:苏裕心指导老师:郑学礼教授王景林研究员摘要食源性致病菌引起的疾病是威胁人类健康的重要因素,也是造成人类死亡、财产损失的重要原因。目前,对食源性致病菌的检测主要依靠传统的分离培养无法满足公共安全卫生监控、临床诊断、流行病学调查等实际需要。食源性致病菌如痢疾志贺菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肉毒梭菌等仍然是严重威胁人类生命和健康的常见、重要食源性和传染性致病菌。所以,为有效监控食品、市场化是美国应用生物系统公司年推出的仪,从而实现了佣性到定量的飞跃。日前应用最为广泛、最具有应用前景的是探针法。该技术的基本原理是在扩增时加入两条寡核苷酸短链引物和一条双标记的探针。当探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。随着慕校馇忻富钚裕秸’端的荧光分子从探针上切割下来,淬灭分子失去对荧光分子的淬灭作用,从而使荧光分许多食品基质、培养基、核酸提取试剂都可能会对幸种谱饔茫贾检测敏感性显著降低,甚至出现假阴性结果。通过改善样品预处理过程来解决这种抑制现象,并通过一些手段对处理后的每一个从衅拦溃磁卸抑制是否消除。目前,唯’‘能够达到这种目的的途径就是在荧光定量从体系中引入内质控⑶以偌尤胍惶跄芄挥隝特异结合的标记有另一硕士学位论文和免疫学分析等方法,耗时长、操作繁琐,每次只能确定或排除一种病原体,生活用水的卫生安全,建立多重、快速、有效的检测技术十分必要。荧光定量际跏暧扇毡救薍第一次提出,真正当引物延伸至探针位置时,阜⒒悠子发出荧光,切割的荧光分子数与锏氖砍杀壤
种不同荧光基团的探针,在同一个反应体系中,通过这两个标记有不同荧光染料的探针,就可以既达到定量检测靶序列的目的,又能同时对男驶蛞制现象进行有效评估。本研究拟采用金黄色葡萄球萧、痢疾志贺莴、沙门氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌为研究对象,通过生物信息学、分子生物学等方法分析,遴选出各病原菌的特异性基因,建立几个基于探针的多重方法,既能定量检噬茵体曜嘉镏实闹票秆芯浚薪鸹粕咸亚蚓舛舅筠福〖仓竞径的分析,以及模拟样品和实际样品特定微生物量值溯源传递途径的分析、评ü齦删錎标准物质候选物的制备研究,进行金黄色葡萄球菌,痢疾志贺菌,沙门氏菌,肉毒梭菌等食源性致病菌定量标准物质肧系统建立一种高敏、特异、简便、快速的检测金黄色葡萄球菌、痢疾志贺茼、沙门氏菌、肉毒梭菌等食源性致病菌的方法,并仪器上对所建立的体系进行评估。突变株为候选物,研制用于食源性致病菌核酸量值溯源的一级标准物质。株、痢疾菌肉毒梭菌株、株、株为侯选物,研制食源性致病菌≡窠鸹粕咸亚蚓〖仓竞鼐趁攀暇舛舅缶鹊奶匾煨曰设计引物和探针,将筛选出的引物及探针进行榷裕范ㄆ涮匾煨裕⒓觳馓逑怠詑从μ逑到杏呕范ㄗ罴训囊铩⑻秸肱ǘ取攵越鸹粕咸亚蚓〖仓竞鼐趁攀暇诜从μ逑到砑尤肽谥中文摘要测致病菌特异基因信号,又能同步检测到控制假阴性的藕拧Mü齦菌,沙门氏菌等食源性致病菌基冈组核酸定量标准物质的制备研究。同时将各病原菌的特异性基冈克隆到相应质粒载体中作为其溯源的工作参考物质,然后以该工作参考物质为基础,通过技术完成微生物量值溯源传递途估。日的:的制各研究。在方法:詌删寰與鹌暇鶤辍⑸趁攀暇鶤核酸定值二级标准物质。因保守区;用,Ⅱ
控⒍訧浓度进行优化。通过利用另一个标记不同荧光基团的探针来检测藕牛固逑的芡奔觳釯与靶基冈扩增。时检测到这三种不同型的肉毒梭菌。占杲椿蚴称废喙夭≡谋曜季甓蕴逑档奶匾煨越醒橹ぁ∪∩鲜种病原菌定量检测靶序列的两端序列,用设计合成引物,扩增含靶序列的片段,连接入靥澹菇üぷ鞑慰嘉茵液倍梯度稀释液提取的为模板,对反应体系的灵敏度进行评估。株污染饮用水和牛奶,用肉毒梭葡株、株、⒌奶ü圆煌椒ㄌ崛删錎进行比较,最终选取用公司的提取试剂盒提取纯化得到曜嘉镏一级标准物质2⒕体突变株九ü粤街植煌约梁刑崛∠妇鷊斜冉希钪昭∪∮帽本备食源性致病菌核酸标准物质侗曜嘉镏。Э谏鲜瓯曜季暄橹け咎逑堤匾煨裕峁鋈盏木陌谢蛴刑异性扩增,其他细菌均无扩增,即没有扩增信号出现,显示体系是ヌ匾斓摹无论的基因是否有扩增,内质控┰龅腏荧光均出现阳性信号攵金葡、痢疾、沙门菌珻鲅纷笥摇⒌墓ぷ鞑慰嘉锵咝灾柿6勘曜记逤涤肽0蹇奖词柿己玫南攵匀舛舅缶鶤/疎三型,建立三重反应,能在一个反应管中同重组质粒,并用盖邢咝曰肊液稀释制成标准模板溶液,构建工作参考物标准曲线。直鹨短荻认∈偷纳献鞑慰嘉镏刈橹柿!⒋、痢疾菌辍⑸趁攀暇鶤牛奶来模拟实际样本,采用