文档介绍：大连医科大学
博士学位论文
骨髓间充质干细胞定向分化肝细胞并肝内移植及软肝煎应用对
肝纤维化形成大鼠肝功能影响的研究
姓名:安伟德
申请学位级别:博士
专业:中西医结合临床
指导教师:胡祥
20050601
骨髓间充质干细胞定向分化肝细胞并肝内移植及软肝煎应用对肝纤维化形成大鼠肝功能影响的研究摘要博士研究生指导教师指导小组安伟德胡祥教授徐迎新研究员中西医结合俅再生医学是本世纪在生物医学史上重要工作之一。肝脏再生及干细胞的作用一直是大家研究的一个热点。目前干细胞移植研究多集中在胚胎干细胞、骨髓干细胞等,由于胚胎干细胞存在着伦理、法律、免疫排斥反应等问题,难以用于临床。自体骨髓来源肝细胞移植作为新的治疗肝衰竭病人方法已被人们所关注。最近研究表明,骨髓间充质干细胞琈具有多向分化潜能,包括向神经、血液、心肌、肝细胞等分化,这些引起了专家们对骨髓间充质干细胞可塑性的极大兴趣。骨髓来源肝细胞移植不仅解决自体肝细胞获取困难、增殖性差等问题,同时为肝脏再生组织工程研究提供了一个平台。为了探索骨髓间充质干细胞横向分化为肝细胞的作用机制,研究骨髓源性的肝细胞肝内移植定向分化,我们向肝纤维化形成大鼠肝脏内移植经诱导的骨髓问充质干细胞来源的肝细胞,观察其分布、分化情况,并观察联合应用中药软肝煎对肝纤维化形成大鼠肝脏功能改善的效果。,利用掷胍好芏梯度离心法结合贴壁法实现骨髓间充质干细胞的体外分离纯化、培养、传代扩增。取第墓撬栉食渲矢上赴τ昧魇较赴羌觳庀赴砻婵乖瑿、、,对骨髓问充质干细胞进行鉴定。流式细胞仪观查结果显示、、阴性,、阳性。表明提取、分离、培养是非骨髓造血细胞的骨髓问充质干细胞。取第墓撬栉食渲矢上赴詌×痗的密度分别种植在六孔培养板中,。对诱导产生的细胞,应用免疫荧光法进行肝细胞特异性标志妥缘鞍准觳狻F渲邢赴觳獬鲇蠧、和专业名称·
自蛋白阳性。以白蛋白阳性细胞数计算诱导分化率。用检测诱导后的肝细胞中自蛋白的阳性表达。,在培养液中分别加入浓度分别为痬/、痬硪蛔橹胁缓珺H缓蠓胖迷孵箱中孵育。分别于孵育、、和小时后,应用免疫细胞化学方法以及台盼蓝排染法,测定标记指数以及标记后的细胞活性。我们发现以/加入单细胞悬液中,孵育小时是最理想的标记浓度及孵育时阊,其中肝细胞标记指数为..ィ昙呛笙赴钚月史直鹞±%。同时行大鼠肝纤维化形成模型的制作,应用和植物油比例是,以痥皮下注射,危埽苣┛稍诟位愎芮⑾∈标记骨髓间充质干细胞及诱导后的肝细胞行肝纤维化形成的大鼠肝内移植。共分三组,每组各十只。第一组经门静脉向肝纤维化形成的大鼠肝脏注射经标记骨髓问充质干细胞悬液⑸含细胞为5诙榫啪猜鱿蚋蜗宋纬傻腟大鼠肝脏注射经标;己诱导后的肝细胞悬液⑸含细胞为生理盐水对照组。二周后处死,取肝脏行免疫组化染色。通过计算机图像分析仪观查在肝脏标记细胞的分布以及白蛋白的表达。结果表明体内诱导骨髓间充质干细胞及体外诱导后的肝细胞均能定向移植到肝纤维化形成的大鼠肝脏组织中。,每组十只。楦蜗宋纬纱笫笞椋珺组每只大鼠分别以的痬盏己蟮母蜗赴啪猜鱿蚋卧嗄谝浦玻琧组单纯软肝煎灌胃组,槿砀渭骞辔讣佑盏己蟾蜗赴啪猜鲆浦沧椤7直鹩治疗后二天、七天、十四天抽血,检测血清、浠=。这些实验研究结果表明诱导后肝细胞移植与中药灌胃联合应用的协同作用能改善肝纤维化形成大鼠的肝功能提高血浆白蛋白含量。本实验研究显示,经大鼠股骨提取分离培养的骨髓间充质干细胞,在体外肝细胞生长因子刺激下能诱导分化为肝细胞。应用标记骨髓间充质干细胞诱导后的肝细胞,经门静脉行肝脏移植,可见在肝纤维化形成肝脏中生长,并有分泌白蛋白功能。在软肝煎中药配合应用下,能够部分改善肝功能。目前对骨髓间充质干细胞的研究多还处于理论阶段,临床应用方面的研究刚刚起步。如果骨髓间充质干细胞能在体外大量诱导分化为肝细胞,就能寻找到骨髓间充质干细胞来源的肝细胞直接移植治疗肝衰的有效方法,在软肝煎中药配合应用下作用更加明显。·
关键词:结论:⒘艘恢侄唐谀诳焖儆行У母患⒋炕笫驧姆椒ǎü魇较胞术分析的表型,鉴定纯度。撬杓涑渲矢上赴嘌褐屑尤際痬和体外可以定向分化为肝细胞。痬跤∈蹦芄槐昙枪撬桎坛渲矢上赴撬杓涑渲矢上赴疤逋庥盏嫉母蜗赴茉诖笫蟾蜗宋纬苫肪持蟹化,诱导后产生的肝细胞在大鼠肝纤维化形成环境中,白蛋白表达细胞数更多。盏己蟾蜗赴浦灿肴砀渭骞辔噶:嫌τ枚蕴岣