文档介绍：山东农业大学
博士学位论文
玉米异交不亲和基因Ga1-S的遗传定位及其过程的转录组和蛋白
质组分析
姓名:刘怀华
申请学位级别:博士
专业:作物遗传育种
指导教师:陈化榜
2011-06
山东农业大学博士学位论文
中文摘要
玉米(Zea mays L.)异交不亲和是玉米自交与正交亲和,而反交不亲和的一种雌雄配
子互作现象。高等植物传粉受精是一个复杂的生理生化过程,从花粉粒在柱头上的识别、
吸水、萌发、穿过柱头和花丝,到花粉管进入子房和胚囊,最后释放精细胞并和卵细胞
受精结合。花粉与花柱胞间互作调控细胞的命运、形态与迁移模式:花粉与亲和柱头的
表皮细胞外基质结合后,花粉管萌发穿透柱头;在花柱传导束中接受其引导、营养而快
速伸长。这些过程通过胞间表面分子的信号交流,起始细胞内的信号级联反应,从而调
控细胞核内基因的表达。因而花粉与花柱互作过程是研究胞间互作的理想模型。Ga1-S
异交不亲和突变体,是研究上述过程中基因表达和调控的理想材料。目前国内外既没有
报道与 Ga1-S 紧密连锁的分子标记,也没有报道 Ga1-S 的精确遗传定位,对于玉米花丝
转录组蛋白质组的研究也未见报道。
本研究首先观察花粉与花丝的互作过程,确定玉米Ga1-S异交不亲和发生的组织部
位与时期;其次从遗传学的角度,利用回交群体构建Ga1-S的遗传图谱,为Ga1-S的分子
标记辅助选择以及最终克隆Ga1-S奠定坚实的基础;最后通过转录组与蛋白质组学的分
析,初步揭示异交不亲和的机理。本研究获得的主要试验结果如下:
1 异交不亲和的表型鉴定:对401D自交(GG×GG)、401D对W22授粉正交(gg×GG)、
W22对401D授粉反交(GG×gg)组合,3个组合每个组合100个植株的结实情况进行定性调
查,结果表明,401D自交(GG×GG)、正交(gg×GG)两个组合正常结实,只有反交(GG×gg)
组合没有籽粒,表明异交不亲和基因Ga1-S的遗传效应在近等基因系中一致,401D异交
不亲和性彻底。利用荧光显微镜观察,结果表明ga1型花粉管在Ga1Ga1型花柱中的伸长
受阻,部分花粉管的顶端苯胺蓝染色加深,发生胼胝质积聚、膨大。2小时前,三组合
的差异不显著;2小时后自交与正交花粉管的平均伸长速度为10mm/h;2小时后反交花
,最长至5cm左右;确定玉米Ga1-S基因异交不亲和发生
的时间段是授粉后2~10 h,ga1型花粉管能够在Ga1Ga1型花柱传导束中伸长,但2 h后与
对照相比伸长速率减缓,10 h后与对照差异显著,20 h后开始部分降解,最终不能达到
花丝基部。
2 构建回交群体BC1F1(W22// W22/401D),通过结实性调查进行表型鉴定,173个单
株中可育的有85株,不育的有88株,统计分析表明符合孟德尔回交群体1:1遗传分离规
律,进一步验证异交不亲和基因Ga1-S为主效显性单基因;遗传群体的基因型鉴定,首
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玉米异交不亲和基因 Ga1-S 的遗传定位及其过程的转录组和蛋白质组分析
先利用玉米第4号染色体上现有的SSR标记,筛选出5个与Ga1-S连锁的标记,Ga1-S基因
初步定位于umc2410与umc1294之间;其次利用生物信息学工具在初定位区间内的BAC
上逐一开发新的SSR标记,最终将玉米异交不亲和基因Ga1-S定位于玉米4号染色体短臂
标记AC184840-2与AC184772-1之间,所有分子标记与Ga1-S基因的可能排序为由玉米4
号染色体短臂近着丝粒一侧起依次为umc1682 、 umc1164、 umc1758、 umc2410、
AC184840-2、Ga1-S、AC184772-1、umc1294。在标记AC184840-2与AC184772-1区段内
有 11 BACs (AC184840, AC194254, AC203042, AC191393, AC184113, AC180823,
AC205353, AC214441, AC196002, AC210943, AC184772).
3 利用高通量测序数字表达谱,比较授粉后 5 小时的自交(GG×GG) 与反交(GG×gg)
花丝的转录组表达谱,并进行了荧光定量 RT-PCR 的验证。结果表明 641 个基因表达上
调,737 个基因表达下调;差异基因功能富集于分子结构调节活性,包括 66 个基因,其
中 31 个基因表达上调,35 个基因表达下调,它们主要参与信号转导、细胞运输、细胞
组织等过程;并从中筛选出 17 个可能与异交不亲和相关的候选基因,它们包括
Mitoch