文档介绍：口腔内科论文口腔上皮细胞论文: 口腔黏膜上皮细胞体外培养的影响因素分析及改进方法[摘要] 目的分析人口腔黏膜上皮细胞培养的影响因素, 并建立稳定的细胞培养体系。方法新洁尔灭和硫酸庆大霉素联合处理口腔黏膜标本,比较不同浓度的 Dispase 对上皮的分离作用, 酶消化法分离细胞, 采用无血清培养液进行原代和传代培养。结果微生物污染得到有效控制, % 的 Dispas e 的上皮分离效果优于 % 的 Dispase , 细胞在短期内快速稳定增殖。结论人口腔黏膜上皮细胞的原代培养方法经改进后可简化操作,并提高成功率。[ 关键词] 细胞培养;口腔黏膜;上皮细胞人口腔黏膜上皮细胞的体外培养对于研究口腔黏膜上皮细胞的生理、病理变化, 上皮癌变过程以及组织工程化黏膜的构建具有重要意义。多年来, 国内外许多学者一直致力于获得更为完善有效的口腔黏膜上皮细胞的培养体系。但是微生物的污染、人类黏膜组织来源的限制、上皮细胞不能贴壁以及所需营养成分复杂等仍然是上皮细胞培养成功的主要影响因素[1] 。本研究对这些影响因素进行分析, 试图通过培养体系的改进而探索更好的口腔黏膜上皮细胞的体外培养方法。 1 材料和方法 组织来源 200 4年10月— 200 5年6 月于吉林大学口腔医院口腔颌面外科取唇裂修复术、智齿拔除术和鳞癌手术切除的口腔黏膜正常组织 24 例,患者年龄 6 个月~ 76 岁。其中,鳞癌患者的正常黏膜取自手术切除组织的边缘, 并经病理切片证实无上皮异常增生,也未发生癌变。 主要试剂分离酶 Dispase 和角化细胞无血清培养液( keratinocyte-serum free medium , K-SFM )( Gibco 公司,美国); 胰蛋白酶( 上海生物工程有限公司); 胎牛血清( 天津灏洋) ;鼠抗人广谱单克隆角蛋白抗体 AE1/AE3 及 SP 免疫组化试剂盒(福州迈新) ;其余试剂均为国产分析纯。 主要仪器和器材 CO2 饱和湿度细胞培养箱( Napco 公司,美国) ;倒置相差显微镜( Olympus 公司, 日本); 超净工作台( 苏州净化设备厂); 一次性细胞培养板和培养皿( NUNC 公司, 丹麦); μm 微孔滤器( Corning 公司,美国)。 方法 标本处理无菌条件下所取的口腔黏膜组织立即保存于 D-Hank ′s 液中, 半小时内运送至细胞培养室。超净台内组织标本经 PBS 洗净血迹, % 的新洁尔灭(苯扎溴铵) 溶液浸泡 2 min , 再用含有硫酸庆大霉素的 PBS ( 2g/L ) 依次浸泡 10min 、 3min 和 2min 。处理后的标本经眼科剪剪去部分黏膜下组织,并修剪成 cm × cm 大小的组织块。 黏膜上皮的分离所有黏膜组织被随机分为 2组。一组黏膜标本放入 % 的 Dispase 中,另一组黏膜标本放入 % 的 Dispase 中,2 组均置于 4℃下消化 22h。取出后用眼科镊分别夹持标本的上皮层和上皮下层, 将上皮分离下来, 弃去上皮下层。经3 位实验者完成操作, 并一致确认每例标本上皮分离的结果,评判标准如下。①有分离作用:标本的上皮被完整或部分分离下来;②完整分离作用: 每块标本的上皮均被完整分离下来;③无分离作用: 每块标本的上皮均不能分离下来。分别记录每组有上皮分离作用的例数, 计算分离率。分别记录每组有完整分离作用的例数, 计算完整分离率。比较 2 组分离率和完整分离率。 上皮细胞的培养原代培养方法:上皮经 PBS 冲洗后加入到 % 胰蛋白酶与 %EDTA (1∶1 )的混合消化液中 37℃下消化 5~ 10 min (2 min 振荡 1次) ,轻轻吹打, 用含 10% 胎牛血清的 D-Hank ′s 液终止消化, 用吸管吹打成细胞悬液,经 200 目无菌尼龙滤网过滤。 PBS 洗涤 2遍, 离心 500 r/min × 10 min 。细胞沉淀在 K-SFM 中重悬,血球计数板计数。细胞悬液以 × 105 个/cm2 的密度接种于培养板中,置 37℃ 5%CO2 细胞培养箱中静置培养。第 3 天首次换液, 培养液移入新孔中使未贴壁细胞继续贴壁。以后隔天换液 1 次。传代培养方法:当细胞达到 80% ~ 90% 汇合时,吸去培养液, % 胰蛋白酶与 %EDTA (1∶1) 的混和消化液消化细胞, 至镜下观察细胞突起回缩, 细胞变圆时终止消化, 吸管反复吹打,离心 800 r/min ×8 min , K-SFM 重悬细胞沉淀,细胞悬液以 1∶2 的比例接种于培养板或培养皿中继续培养,以后隔天换液 1