文档介绍：实验 6 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 5’5’ 3’3’一、实验目的?掌握稀碱法分离酵母 RNA 的原理与操作过程。?了解 RNA 的组分并掌握定性鉴定的具体方法。二、实验原理?由于 RNA 的来源和种类很多,因而提取制备方法也各异,一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后, RNA 即溶于上层被苯酚饱和的水相中, DNA 和蛋白质则留在苯酚层中,向水层加入乙醇后, RNA 即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去 DNA 和蛋白质,提取的 RNA 具有生物活性。?酵母细胞富含核酸,且核酸主要是 RNA ,含量为干菌体的 %~% , 而 DNA 含量较少,仅为 %~% 。为此提取 RNA 多以酵母为原料。工业上制备 RNA 多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的 RNA ,主要用作制备单核苷酸的原料, 其工艺比较简单。?稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解, 然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA 或调利用等电点沉淀。提取的 RNA 有不同程度的降解。浓盐法是用高浓度盐溶液处理,同时加热,以改变细胞壁的通透性,使核酸从细胞内释放出来。二、实验原理? RNA 含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使 RNA 水解,从水解液中可用定糖,加钼酸铵沉淀(或用定磷法)和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。( 1)嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。( 2)地衣酚显色法:核糖核酸与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变为糠醛,后者与地衣酚( 3, 5-二羟基甲苯) 反应呈鲜绿色,该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。(3)磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀[(NH4)3PO4 · 12MoO3 ↓]。二、实验原理三、仪器、原料和试剂?仪器:试管;试管架; 100mL 氢氧化钠烧杯;移液管 (×1)、 (×2)、 1mL (×2); 量筒 10 mL 、 50mL 各一个; 滴管;水浴锅;离心机;布氏漏斗。?原料:干酵母粉三、仪器、原料和试剂?试剂: (1) % 氢氧化钠溶液; (2) 95% 乙醇; (3)乙酸、乙醚; (4) 10% 硫酸; (5) 硝酸银溶液; (6) 1mol/L 浓氨水; (7)酸性乙醇溶液: 30mL 乙醇加 HCl ; (8)三氯化铁-浓盐酸溶液:将 2mL 10 %三氯化铁( FeCl3 · 6H2O )溶液加入 400mL 浓 HCl 中; (9)地衣酚-乙醇溶液:称取 6g 地衣酚溶于 100mL 95 %乙醇; ( 10 )钼酸铵试剂:将 2g 钼酸铵溶解在 100mL10% 硫酸中。四、实验步骤?1、酵母 RNA 的提取?称 4g 干酵母粉悬浮于 40mL %NaOH 溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入 100mL 烧杯中沸水浴加热 30 分钟, 不断搅拌。冷却, 3000r/min 离心 10-15 分钟后,将上清液慢慢倾入 10mL 酸性乙醇,边加边搅。加毕,静置,待 RNA 完全沉淀, 3000r/min 离心 3min 。弃去上清,用 95% 乙醇洗涤沉淀两次(每次约 10ml ),继而用无水乙醚洗两次(每次 10ml ),洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀。用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤,沉淀在空气中干燥。称量所得 RNA 粗品的重量。?2. RNA 组分鉴定水解 RNA :取 ~1g 提取的核酸,加入 10% 硫酸 10mL 沸水浴加热 10 分钟制成水解液,然后进行组份鉴定。(1)嘌呤碱:取一支试管,加入 1mL 水解液, 加入过量浓氨水(约 2mL )。然后加入 1mL 硝酸银溶液,观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。(2)核糖:取一支试管,加入水解液 1mL ,三氯化铁浓盐酸溶液 2mL 和地衣酚乙醇溶液。放沸水浴中 10min 。注意观察核糖是否变成绿色。(3)磷酸:取一支试管,加入 2mL 水解液,然后加入 5滴硝酸银和 1mL 钼酸铵溶液后,在沸水浴中加热,观察有无黄色磷钼酸铵沉淀。五、计算 RNA 提取率( % ) =RNA 质量( g)/干酵母粉质量( g)× 100%