文档介绍：扬州大学
硕士学位论文
两种来源青霉素酰化酶基因在大肠杆菌中克隆和表达研究
姓名:张爱晖
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:姜涌明;袁中一
20020501
中文摘要也取得了一些进展俊冉ɡ资掀章尥撬褂┣嗝顾谿酰化酶基因克隆到大的两种来源蚍直鹂寺≈罷启动子控制下的表达裁体中,┗废岬闹嘏潘嵘和。蔷硎腔岢砂胩ń浞遥谠徒耗由乇9丶谋;同薅,P芄薮课憾应的嫩反应,即催化邗0纺负擞肫渌W牍┨。戳魏凇欤邗0房箍鞴ぜ嘀邪缪萘思渲匾T辖巧āP矶圉窬含有颍缇薮笱挎唏菌,粘节杆菌饶仕嵛〔侄暇资掀章尥撬咕7嗖钚⑹志。这些来源的谢相似的蛋白结构,氨基酸序列的高度同源性繇示它们可能由间一祖先衍变而来。虽然抗生素工业上主鼗采用来源的瞧浞煊м览丛吹腜具骞其他不同性质,如丑来源梢宰饔糜诓煌掷嗤锋呔豧¨,积囊来源贐巾表达并分泌至憨努【俊疘甤来源詐⑽露取⒂谢芗恋鹊奈榷ㄐ苑浅8。利用蛋皇矮工程手段改造置噬Q噍志哂型饭枯鏊豦羲纯酶活毪熬王幸筝瑟抒藏猓概诵筇ǚ忍後猿啊本论文通过聚合酶链式反应竦昧岁蒫蚝蚉基魏。穿捌测定和计算梳联辩结栗表明:甤一数;畆蛄杏胛南妆ㄥ的同源性只有,ィ嗦氲陌被嵝蛄杏胛南走e芡葱晕%,舜嬖谕槐洹=建了袭达质粒蚿,并分掰转纯大肠杆菌玫交因工穰菌鼗。对基因王稷萤进行了发酵条件的优化,研究浓度、发酵温度和不同碳源对蛞捍抟影响。在℃、/孀堑奶跫拢挂砸嵝П泶铩虰谋泶锘直鸫锏././隚珽扬州大学硕士学位论文
关键词青霉索酰化酶雷氏普罗威麓斯菌大肠栝蕊克隆与表达其中,的表达量比野生菌岣叨墨墨矍楸邛咚苋ホ孕┒槟ɡ锉ぼ眩皇诶堕塞堕墨耋堕锫。袭这量越过了迄今文献掇道静在大弱秆麓表达钵系孛静簸亳承警。对囊狡稳定性的研究表明,两种基因工程菌在涎选择压条件下能够稳定传代到代。这个传代数已大大超过实际生产掰需要豹培养对黼。这就为工敛纯生产封下了良好豹基础。
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把包括信号肽、小亚基、连接肽和亚基,经过后加工,去除信号肽和连接肽,产致和青霉素韵妇纳鄙肆υ嚼丛饺酰⑶矣捎谇嗝顾谿在胃合成方面还有其它很大的用处。它除了催化中的酰胺键水解之外,还能催还能催化水解反应的逆反应,即酰胺键的合成。把不同的侧链通过羰基连接到成青霉素类抗生素,还能合成头孢霉素类抗生素,在半合成邗0防嗫股氐生产方面显得更为重要【¨】。,,如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、丝状真菌和酵母中【。,。前牒铣青霉素的中间体。根据催化水解底物不同,可分为三类【浚核馇嗝顾谿的青霉素酰化酶称为青霉索;虺芇凰馇嗝顾孽;赋莆G嗝顾豓酰化酶虺芇凰鈇的酰化酶称为酰化酶虺艫。甤、来源的青霉素;及来源的青霉素;已克隆并测定全部序列。其中,结构和功能研究比较清楚的是甤丛吹腜。刚产生的俏藁钚缘那疤宓鞍祝生虰亚基,组装成有活性的年,⑾至饲嗝顾谿。它高效广谱的抗菌效果使之在临床中广泛使用,但是,在其使用过程中许多微生物对青霉素产生了耐药性,导中不稳定,需要注射等原因,因此需要对青霉素懈脑臁】。为了使邗0类抗生素具有新的疗效,可以在保持其抗菌结构母核的前提下,改变其侧链,使其成为对细菌敏感的具有疗效不同、作用时间不同的抗生素。早在年代就已用微生物转化成为氨揭宜酙K孀琶腹潭ɑ际醯某墒欤沟们霉素酰化酶在工业上的应用成为可能。除了生产猓嗝顾黪;冈谟谢化其它化合物中酰胺键、酯键的水解,用于有机合成中活性基团的保护。近年来利用它的底物专一性及对映体的选择来进行光学异构体的合成和拆分。此外,。这就说明。它不仅能合扬州大学硕士学位论文珽、爿
,青霉素酰化酶的基因结构和表达调控主要集中在对青霉素;的研究。因。结构基因由编码信号肽、腔⒘。在调控基因大肠杆菌虮泶锸苋龇矫娴牡鹘冢篶芴宓鞍住1揭宜岷臀露【】。诖蟪Ω司械谋泶锕讨校梢镅由焓笛橹っ鱌基因的转录是动予和三个不完全的回文结构的排列类似于碳源调节有关基因和操纵予的排列以大肠杆菌青霉素;傅幕蛭@得髑嗝顾仵;富蚪峁见4蟪Ω司鶳基因分为两部分:一部分是结构基因,另一部分是调控基中,有两个结合位点、.、坏慵叭霾煌耆ǖ幕匚慕峁。结构基因的舜嬖谝桓鰎依赖的发夹结构作为终止子。夺径冷夺;由单一启动子启动的。两个岷衔坏阄挥谄舳恿诮颍云舳悠鹫调节作用;三个不完全的回文结构可能对启动子起负调节作用。这两个⑵—;琧霍辧张爱