文档介绍：苏州大学
博士学位论文
人胚胎神经干细胞体外诱导分化及其分化相关基因表达的研究
姓名:王飞
申请学位级别:博士
专业:神经外科学
指导教师:黄强
20030501
人胚胎神经干细胞体外诱导分化及其分化相关基因表达的研究摘要第一部分:不同胎龄的人胚胎神经干细胞的体外培养研究【目的】探索人胚胎神经干细胞体外分离培养的条件,并观察其在体外增殖、分化的特点;建立人胚胎神经干细胞分离、培养及分化的鉴定技术,在体外大量扩增培养神经干细胞,为下一步的研究提供足够的材料。【方法】分别取水囊引产绿チ涞娜伺咛ズ兔追撬就A鞑芴チ涞娜伺咛ィ从胎脑皮层分离组织,采用胰蛋白酶消化和机械吹打的方法获得单细胞悬液。部分细和痬刺激细胞增殖,从而进行体外扩增培养、连续传代。采用染色和相差显微镜观察细胞形态,常规染色观察神经干细胞的染色体,免疫【结果】从人胚胎脑分离的细胞在含有蚥奈扪G迮嘌校苄纬大量的神经干细胞球,这些神经干细胞球可在体外扩增及传代培养。免疫细胞化学和免疫细胞荧光法鉴定神经干细胞球中大部分为表达阳性细胞。这些神经干细胞也能培养出具有同样特征的神经干细胞。流式细胞仪和细胞生长曲线的结果表明神经干细胞在体外无血清培养加入蚥/奶跫戮弑附锨康脑鲋【结论】从引产或流产的不同胎龄人胚胎脑皮层分离出的细胞,在含有蚥胞冻存,另一部分细胞进行体外培养。采用无血清培养基疐尤隕细胞化学和免疫细胞荧光法鉴定神经干细胞和分化成熟的神经元星形胶质细胞及少突胶质细胞S昧魇较赴呛拖赴で叻检测神经干细胞的增殖能力。胞球贴壁分化后可以出现虲表达阳性的细胞。经冻存后的胎脑细的无血清培养基中培养,见到了具有自我更新能力和多向分化潜能的神经干细胞。经能力。人胚胎神经干细胞体外诱导分化及其分化相关基冈表达的研究中文摘要
第二部分:人胚胎神经干细胞体外增殖、分化的研究冻存的胎脑细胞同样能培养出具有同样特性的神经干细胞。特别是从药物流产的人胚胎脑皮层可以培养出神经干细胞,加上取材方便,可以认为本研究研究建立了一个随生长因子T谂嘌牡天,每天用ú舛ㄏ赴腛怠H∪伺咛ツ韵多聚赖氨酸处理的孔细胞培养板,分别在第、旖忻庖哂ü馊色,计数、旧粜缘谋嚷省H伺咛ド窬上赴又值椒胖糜卸嗑劾蛋彼处理的玻片的孔细胞培养板,分别用不同浓度的胎牛血清%、ァ%、%人胚胎神经干细胞接种到放置有多聚赖氨酸处理的玻片的孔细胞培养板,被分为【结果】ǖ慕峁砻鳎珽榈腛得飨愿哂谄渌髯椋崾的人胚胎神经干细胞,.疭期分别为ズ.%。而人胚胎脑细胞患殖状态。不加生长因子,神经干细胞逐渐停止增殖。“神经干细胞库”。【目的】探讨在体外培养过程中影响神经于细胞增殖和分化的因素。【方法】人胚胎神经干细胞被分为椋篍组黾/、组加和痬、对照组患胞患由ひ蜃培养,于第、煊昧魇较赴遣庀赴芷冢蝗≡嘌人胚胎神经干细胞于第天用流式细胞仪测细胞周期。人胚胎神经干细胞接种到诱导其分化,诱导天后进行免疫荧光染色,计数、旧粜缘谋嚷省、组黾∥⒍哉兆加和痬。撤去生长因子后细胞开始分化,天后进行免疫荧光染色,计数、旧粜缘谋嚷省组的细胞增殖能力最强。流式细胞仪的检测结果为:原代培养的和生长因子趌珿甅,谖.%;,神经元和星形胶质细胞的比例分别为繭.%和.%;到贴壁分化天时,神经元和星形胶质细胞的比例分别达到.±ズ纎.%。加/椋篍组黾痬人胚胎神经干细胞体外诱导分化及其分化相关基因表达的研究中文摘要Ⅱ
第三部分:维甲酸诱导人胚胎神经干细胞向神经元分化及相关基因的表达增殖。人胚胎神经干细胞的分化受多种因素影晌。随贴壁分化时问的延长,人胚胎神神经元的比例。用/奈姿嵊盏既伺咛ド窬上赴谟盏记啊⒂盏天和诱导欤崛∠赴淖躌。用半定量法检测基因、和【结论】全反式维甲酸能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例,的维甲酸是最合适的浓度。基因、和在人胚胎神经干细胞分化为神经元的过程中起重要作用,基因为负调控作用,蚭清浓度的增加,与对照组相比,染色阳性细胞明显增加,,【结论】蚥茉谔逋馀嘌跫麓俳臀秩伺咛ド窬上赴姆至押经干细胞逐渐分化为成熟的神经元和星形胶质细胞。胎牛血清的浓度越高,人胚胎神经干细胞分化为星形胶质细胞的比例越多。盏既伺咛ド窬上赴嗟姆只为星形胶质细胞,诱导人胚胎神经干细胞更多的分化为神经元。【目的】探索全反式维甲酸对人胚胎神经干细胞的诱导分化作用,并研究在人胚胎神经干细胞向神经元分化过程中相关基因的表达。【方法】用不同浓度./疞、//的全反式维甲酸在体外诱导人胚胎神经千细胞。诱导旌螅鯪免疫荧光染色,计