文档介绍：第二军医大学
博士学位论文
半夏凝集素基因的克隆及对菘蓝的遗传转化研究
姓名:许铁峰
申请学位级别:博士
专业:生药学
指导教师:张汉明;唐克轩
20030401
摘要的敏感浓度,结果表明菘蓝外植体对比对舾校疞的是养等步骤,获得了菘蓝的对的再生抗性植株,。抗性植株的粜月饰%。选取四株粜灾按ㄌ崛∽茯跘进行杂交分析,分别采用蠳咏环治觯晕醋;妮坷蹲躌为阴性对照。结果四个样品均出现杂交条带,而阴性对照未出现杂交条带。分子检测的结果说明外源中比对分析,蚝推渌炷闲强浦参锢丛吹哪鼗蛴泻芨咄葱浴N们构建了以F舳樱訬旅顾亓姿嶙R泼基因作为选择标记基因的植物双元表达载体。通过冻融法将导入农杆菌株系,构成本实验所用的基因工程菌。糯顾和卡那霉素妮坷锻庵蔡逶偕嘌疾燧坷锻庵蔡转化菘蓝合适的筛选浓度。以菘蓝的子叶和下胚轴为外植体,采用叶盘转化法进行菘蓝的遗传转化,并以未转化的相同外植体同法操作作为阴性对照。经过共培养、,峁砻骺剐灾仓暝谀康位置Τ鱿痔醮醋;坷对谙嘤ξ恢梦闯鱿痔醮醪奖砻鱬制性内切酶酶切总峁砻、叛烦鱿忠桓鎏醮、叛烦鱿两个条带,未转化的菘蓝未出现任何条带。取上述四个样品以法提取总蛞丫辖胼坷痘蜃椋琹、叛肺R桓隹奖矗、叛肺A半夏凝集素蔷な刀酝崮坷コ婢哂刑匾於拘宰饔玫囊焕嗟鞍字剩我们采用术端快速扩增法,犹炷星科植物半夏中克隆得到了全长的半夏凝集素基因嗦肭,编码霭被帷>贕通过对菘蓝组织培养条件的选择,找到了菘蓝外植体右逗拖屡咧直接再生芽的最佳激素配比疞/。配制一系列浓度的分别含街窒个拷贝,蛟谳坷吨心苷1泶铩蚐第一车厌人学博宦垡
有较多的根生出。将完整的转基因菘蓝苗移入移栽基质嗵客粒问渲檠的抗虫性。两周后统计,;虻妮坷断啾龋将经过鉴定的转基因菘蓝无菌苗从培养容器中取出,洗净根上附着的培养基后,室温条件下培养在营养液嘌罅吭K叵∈中,半个月后即等量混合校刻炫缡┯Q次,并用保鲜袋罩住菘蓝苗以保持湿度,两周在装有不含糖的培养基的容器中,以转基因和非转基因菘蓝的叶片作为受试材料,采用桃蚜’作为受试昆虫,考察转莼蜉坷转基因菘蓝具有明显提高的抗蚜虫活性。关键词:遗传转化;根癌农杆菌;半夏凝集素基因后菘蓝苗即可移栽大田正常生长,移栽成活率达到ァ四倍体菘蓝;摘要
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前言菘蓝』是常用中药板蓝根和大青叶的基原植物,王寅等,5谋短遢坷锻短遢坷丁谄渖さ脑缙诤椭衅即目前控制害虫危害的普遍措施是常规抗虫育种和使用化学农药、生物杀虫剂问题难以解决,并且也会带来一些新的问题。例如,通过常规的育种手段来获得量使用,造成农药在植物和药材中残留壳芭┮┎辛舫暌丫晌O拗浦幸┎易控制的生态因素,生态防治仅能在一定程度上控制害虫不成灾。以上这些问题现代分子生物学特别是植物基因工程的迅速发展,为防治害虫提供了~条新途径。其基本原理是将外源抗虫基因构建到合适的载体上,转移进植物并表达,筛选有抗虫活性的植株并经后代选择获得纯系。近十年的研究表明,这种方法与使用农药相比,具有使用安全、经济、选择性强的特点。可以说基因工程技术的发展为培育抗虫植物品种提供了新的手段。开辟了植物抗虫育种的新时代。同翅目昆虫具有刺吸式口器,靠吸取植物汁液为食,为害农作物、园艺作物过伤口嘀种虏〔≡靡郧秩局参铮佣贾伦魑锔Q现氐乃鹗АR虼耍有效控制同翅目昆虫的侵害,不但可以减少害虫造成的直接损失,同时对防治作药材用量极大,因而在全国各地广泛栽培。乔传卓教授课题组经过多年努力,完成了菘蓝的同源四倍体育种工作,经数代选育,得到了性状稳定、繁殖力鲁!根与叶的产量明显增加,且活性成分较大幅度提高的优良品系谴康龋一半以上的生长时间嵩獾酵崮亢土鄢崮亢Τ媲趾Γ现氐赜跋炝艘┎牡牟及生态防治等手段,这些手段在害虫防治方面虽然取得了长足进展,但依然有些抗虫作物品种已陷入了育种时间长、亲本资源缺乏的困境;化学农药的长时间大及中成药出口的瓶颈问题之一斐苫肪澄廴荆踩死嘟】担簧锷背婕劣于其成本高、自然资源有限及抗虫谱窄等缺点,使其应用受到限制;面对众多不的存在和出现,迫使人们不得不去寻找新的抗虫途径。及药用植物,其取食不仅引起了作物的直接损失,而且口器刺入时产生伤口,通物病害也有重要意义。同翅目害虫缪脸是菘蓝栽培中的最严重的害虫之一。目前应用较广的量和质量。刖
,⑶食崮俊双翅目及螨、线虫,却不抗同翅目害虫。有研究表明,专一结合甘露糖的单子叶凝集素基因对同翅目害