文档介绍:PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳
刘琳 1131428 环境科学
一、实验目的
1学****并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。
,并分析相应结果。
二、 实验原理
PCR 扩增
多聚酶链系。
ul的反应体系,并分别添加8种不同的模版,并于第 9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。
,按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达到
30~40 次。程序如下:
预变性:
94C
3min
循环:
94C
变性 30s
55C
退火 30s
72C
延伸 30s
末次延伸:
72C
5min
PCR扩增完成后,将样品取出并保存于15°C环境中。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验
,放到一锥形瓶中,。然后置微 波炉加热至完全溶化,溶液透明。摇匀,待冷却至60C左右,在胶液内加入适量的EB。
,在一端插好梳子,在槽内缓慢倒入已冷至60C左右的胶液,使 之形成均匀水平的胶面。
,小心拔起梳子,使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。
,至液面覆盖过胶面。取1pl缓冲液和5pl待测DNA 样品混合后,用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。
,并接通电源,调节稳压输出,电压最高不超过5V/cm,开始电泳。 点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。
(蓝色)的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处,可停止电泳。
***仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜,赶去气泡平铺,然后把凝胶放在上面。
关上样品室外门,打开紫外灯,通过观察孔进行观察。
五、实验结果与讨论
如图所示:从左至右,分别是模版 1-8号,第9列为阴性对照。
前8列均有明显的条带出现,而阴 性对照无显示,说明扩增整体效果很 好。图中有上下两条线,上面一条线所 覆盖的条带基本可以代表扩增的产生 的片段位置,参照图可以看出扩增片段 在200bp左右。在第9个阴性对照的第 二条线处可以看到较为模糊的条带,并 非是出现假阴性,而是由于二聚物而产 生的条带。通过该条带与最右侧的 marker对比可知该片段出现在100bp左 右,并非由于实验操作等问题而产生的 污染。
实验的照片显示实验结果有拖尾 现象,但是并不影响后续实验。在实验 过程中由于有些试剂加到了管壁上面, 并没有完全加入,可能会出现一些误 差。另外在第1列条带中出现了其他的亮带,可能是由于在前期的扩增实验中滴加试剂时 由于量过少而进行的摇匀和融合等操作产生了非特异性扩增,也有可能是因为胶板制作过程 中梳子的位置不合适或者胶板制作时边缘处不够均匀导致产生污染。但总体而言,实验结果 较为满意。
六、实验注意事项
1•由于PCR技术非常敏感,可使一个DNA分子得以扩增,装有PCR试剂的离心管打 开之前,应先在微量离心机上作瞬间离心使液体沉积于管底。PCR扩增反应的条件,要控 制好温度、时间和循环次数。
2•最好在加完所有其它反应成分后才加模板DNA。
3•配琼脂糖时应使其