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PCR 扩增及 DNA 琼脂糖凝胶电泳
刘琳 1131428 环境科学
一、实验目的
1 ．学****并掌握 PCR 扩增的基本原理与实验技术。
2 ．对扩增后的 DNA 进行琼脂糖
PCR 扩增
本次试验选择细菌 16S rDNA V3 区片段进行扩增。

根据计算，首先取离心管按照 10 × Buffer 、1 ul
dNTP 、 ul 341GC 、 ul
534 、 ul Taq 、 ddH 2O 的比例配置足量的 PCR 反应体系。

分别向 9 个薄壁管中分别加入 24 ul 的反应体系，并分别添加
8 种不同的模版，并于第
9 个薄
壁管中加入无菌 ddH 2 O 作为阴性对照。

将薄壁管放入 PCR 扩增仪中，按照预定程序进行 PCR 扩增。其中循环过程需要达到
30~40
次。程序如下：
预变性：
94 ℃
3min
循环：
94℃
变性 30s
55℃
退火 30s
72℃
延伸 30s
末次延伸： 72 ℃
5min
PCR 扩增完成后，将样品取出并保存于 15 ℃环境中。
DNA 琼脂糖凝胶电泳实验
称取琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的 ×TBE 电泳缓冲液。然后置微波炉加
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热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至 60℃左右，在胶液内加入适量的 EB 。

取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至
60 ℃ 左右的胶液，使之形成
均匀水平的胶面。

待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。

在槽内加入
×TBE 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。取 1μl缓冲液和 5μl待测 DNA 样品混
合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。

接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过
5V/cm ，开始电泳。点样
端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。
观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约
1cm 处，可停止电泳。

在紫外***仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，
然后把凝胶放在上面。关上样
品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。
五、实验结果与讨论
如图所示：从左至右，分别是模版 1-8 号，第 9 列为阴性对照。
前 8 列均有明显的条带出现，而阴性对照无显示，说明扩增整体效果很好。图中有上下两条线，上面一条线所覆盖的条带基本可以代表扩增的产生的片段
位置，参照图可以看出扩增片段在 200bp 左右。在第
个阴性对照的第二条线处可以看到较为模糊的条带，并非是出现假阴性，而是由于二聚物而产生的条带。通过该条带与最右侧