文档介绍：上海第二医科大学
硕士学位论文
定量PCR应用于柯萨奇B病毒检测及抗病毒药的研究
姓名:成威
申请学位级别:硕士
专业:内科学心血管
指导教师:陈曙霞
定量应用子柯萨奇病毒检测及抗病毒药的研究
定量应用于柯萨奇病毒检测及抗病毒药的研究
中文摘要
一倩景病毒性心肌炎是一种常见的心脏疾病,发病率近年呈
升趋势。其临床表现轻重不一,可表现为完全无症状或轻微的不适,亦可为严重的心
脏损害,表现为阿一斯综合征、碎死以及终末期心衰。引起病毒性心肌炎的病毒很多,
但以柯萨奇组病毒最多见,曾有报道,在常规尸检中发现
的心脏标本中可检测到抗原很多临床研究表明以上的病毒性心肌炎是由它
感染所引起。为了解的发病机理,许多研究者己制作了感染所致的心肌炎小
鼠模型。这些模型被广泛用于的自然病史、发病机理及药物和免疫治疗的研究。
在这些研究中,对感染的组织和体液作病毒定量检测是重要的一面。传统的方法是
通过病毒的半数感染剂量或空斑形成单位来检测病毒的感染滴度。然而近年来许多病毒
都有了分子定量检测的方法。为有助于感染所致的的研究,本课题建立了一
种可定量检测感染组织或体液中的方法,先通过基因重叠突变延伸法合成一
个内含突变点即酶切位点的内参片段,然后,将它与由逆转录而来
的样本共同作聚合酶链反应扩增,内参
片段与待测病毒的目的扩增片段仅一个碱基的差别,最后根据己知量的内参来计算待测
样本的量。
对目前尚无特效疗法。随着世纪早期对本病的认识以来,各种治疗包括汞
利尿剂、洋地黄、大剂量维生素、各种抗血清和抗毒素等,无一种治疗能影响本病的
病程。一个世纪已经过去了,仍以长时间卧床休息为主要治疗措施。柯萨奇病毒感染人
和小鼠所致的病程是一样的,小鼠模型的建立促进了其治疗的研究,对治疗产
生了重大的影响。虽然近年来许多药物,如抗炎药,免疫抑制剂,和受体阻滞剂,
钙离子拮抗剂以及血管紧张素转化酶抑制剂,己被用于小鼠模型的治疗研究,但其
作用非常有限,且在临床上未得到证实。因而,寻找有效的药物已成为临床的迫切需要。
本课题组发现苦参的粗提液对感染细胞有保护作用,并能抑制、的增
定川一萨奇病毒检测及抗病毒药的
殃现己将其有效成分制成了纯度为的抗柯注射液
经临床明对患者具有良好的疗效。若能明确其防治的作用机理
其药”学,将“临床应用提供基础理论依据夕
的通过建立一币,竞争法定量定吊
检感染小鼠中的究苦参,抗有效成分对
竹川的机制—抗病毒作用以及作用的量效关系。为抗柯注创液的临床应用提供
论依据。
方法竞争法定量的方法学建立首先以重叠突变延伸法合成一个内含突
变点即切位点的内参片段,与待测病毒的目的扩增基因序州以,仅
一个碱基的差异然后,将它与山逆转录而来的样木。共同作扩增扩
增产物以酶切分离最后根据已知量的内参来计算待测样木的狱、
对竞争法定量的评价及证实抗柯注射液的抗病毒作用检测病毒原液的
感染滴然后将其作倍梯度稀释,以检测每一个稀释度的
八最。对结果作相关回归分析。
小鼠病毒血症及其治疗模型制作取只雄性小鼠随机分成组,每组只,
病毒组只接种病毒,不用药物治疗,每只小鼠腹腔接种了。的
毒液小时后,分别从尾静脉给予生理盐水,一天两次,共天
药物组病毒接种同上,小时后,尾静脉给子剂量为’的抗柯洲则液
而不是生理盐水,一天两次,共天
对照组不接种病毒,每只小鼠腹腔内注射生理盐水,小时后,分别从尾
静脉给予生理盐水,一天两次,共天。
同时用空斑法及分别对每只小鼠的血标本进行检测。对不同检测方法相
关分析证实抗柯注射液的抗病毒作川。
对抗柯注射液抗作用的量效关系进行研究
只雄性小鼠随机分成组,每组只病毒组接种及给药同方法的病毒组
组,组,组,组,组
组方法及步骤同方法的药物组,只是分别从尾静脉给予相应剂量的抗柯射液刘
照组每只小鼠腹腔接种生理盐水,小时后,分别从尾静脉给予生理盐水
人两次,共〕天。
定里应用于柯萨奇病毒检测及抗病毒药的研究
结果对病毒原液不同稀释度的检测结果表明,方法与。呈高度
的直线相关。
对病毒组小鼠的血标本进行检测,表明方法与空斑法明显相关
。
上述与空斑法的检测结果都证实了,抗柯注射液在剂量为岁时有抗
作用,对病毒的抑制率分别为和,但病毒感
染滴度下降比病毒下降更显著
以法测得抗柯注射液的最小有效量为,随药物的剂量增加,其
抗“毒作用增强,具有很好的量效关系丫
结论竞争法定量与传统的空斑法和。检测结果一致,但比后者史敏
感、精确、快速,因而可能有助于病毒的致病机理和在体内外筛选抗病毒药物的研究。
抗柯注射液具有抑制柯萨奇病毒的复制和感染