实验四浓度测定及酶切.pptx

文档介绍：实验四浓度测定及酶切
1、学习利用紫外分光光度法测定DNA溶液浓度和纯度的原理和方法
2、学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA浓度的方法
3、学习利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果，为以后的连接作准备。
一、实验目的
DNA的吸收光谱峰在260 nm处，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50 g/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质的吸收峰在280 nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD260/OD280之值，-，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。
目前已发现I型、II型和III三类不同的限制性内切酶，其中II型能专一识别碱基顺序，并在该处切断双链DNA，因而在基因工程中得到广泛应用。DNA经限制性内切酶作用产生两种断裂状态：粘性末端或平末端。限制性内切酶Hind III识别的碱基序列为：
酶切反应需Mg2+及其它一些辅助离子和一定的盐离子浓度，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高(>5%)，会使酶的识别位点发生改变，产生星活性(star activity)。绝大多数酶的反应温度37℃，也有个别要求在50 ~ 65℃。
二、实验原理
不同核酸样品在OD260=1时的浓度
1、OD260：估算核算浓度
2、 OD280：估算核算浓度
3、 OD260：估算核算浓度
4、 OD260：估算核算浓度
OD（optical density，光密度）：表示被测物吸掉的光密度。
不同核酸样品在OD260=1时的浓度
1、ds DNA = 50 g/ml (ng/ l )
2、 ss DNA = 37 g/ml
3、 RNA = 40 g/ml
4、 oligo = 30 g/ml
OD（optical density，光密度）：表示被测物吸掉的光密度。
三、实验材料（上次实验提取的质粒 pSK和MP3）
四、仪器设备
五、实验用具
Eppendorf分光光度检测仪
NanoDrop分光光度检测仪
电泳仪 微型电泳槽
BioRad凝胶成像仪 紫外透射检测仪
恒温培养箱
冰盒 微量离心管 移液器
微量离心管（ ml1） 吸管头若干 点样板
NanoDrop分光光度检测仪
NanoDrop测定结果
DNA样品纯度好
DNA样品纯度差
DNA样品纯度差
比色皿
Eppendorf分光光度检测仪