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pcr扩增目的基因.ppt

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pcr扩增目的基因.ppt

文档介绍

文档介绍:任务二: PCR扩增目的基因
2021/3/10
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一、实验目的
1、掌握PCR扩增DNA的技术与原理
2、学****PCR扩增仪的使用
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二、实验原理
聚合酶链式反应是一种体外DNA扩增技术,具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等特点。
PCR工作原理类似于DNA的体内复制过程,是将待扩增的DN***段和与其两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物,引物序列将决定扩增序列片段的特异性和片段长度。
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标准的PCR过程分为三步:
  (92℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA
  (37℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
  (72℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延伸,合成与模板互补的DNA链。
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三、实验仪器
PCR扩增仪
台式高速离心机
移液器
高压灭菌后的Eppendorf管( )
电泳仪
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四、材料与试剂
1、模板DNA():用牙签挑取单 菌落悬浮到50μL的裂解液中(1%TritonX- 100,20mmol/LTris-,2mmol/L EDTA),95℃温浴10min,10000r/min
离心5min,取2μL上清液用于总体积50μL的PCR反应。
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2、TaqDNA聚合酶(5U/μL),10×扩增
缓冲液,dNTP(1mmol/L):购买。
3、引物(100pmol/L):设计并合成与目的DNA两侧互补的引物。
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五、实验操作

(1)按序将如下成分混合置于Eppendorf管内
×扩增缓冲液 10μL
×dNTPs 8μL


1μL(10ng)
()
加水至V终=100μL
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(2)手指轻弹Eppendorf管底部
离心2s
(3)加石蜡油50μL封住溶液表面
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