文档介绍：原代肝细胞
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原代肝细胞分离培养与方法
肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝研究的基础，但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大，分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大，方法复杂，成本较高
2 %胶原酶II，请问要消化多长时间最合适？
3 分离的小鼠肝细胞体积太小，只有在200倍镜下才能看清楚，测定细胞活性都很困难，请问这是否正常？
4 肝组织经200目筛过之后，离心时发现滤过液中还有些不溶的组织存留，请问是何原因？一般用两步灌注法！！
％4型胶原酶，胶原酶2型没有试过！！
分离的效果很好，细胞的活力在80％以上！！
你的老鼠太小估计在分离肝脏找到门静脉和插管的时候有难度！！
我的方法是：
，插管！！注意切勿弄破肝包膜，否则灌注的时候有漏液，而导致灌注不充分！！
：第一步用不含钙和镁离子的D-Hanks 含EDTA灌注150－200ML，％的胶原酶4型40－50ML!!
（具体的配方我在细胞技术版讨论中已经上传过你可查找）灌注的时间估计在15分钟左右,胶原酶灌注完以后在37度水
浴10分钟，时间太长酶对细胞膜还是损伤的！！
，加入不含酚红的1640基培，低温离心机700RPM 3分钟离心3次！
获得细胞可以培养了，多的细胞液可以冻存起来！！
“肝组织经200目筛过之后，离心时发现滤过液中还有些不溶的组织存留”
个人认为是你的细胞消化不完全，或是细胞太稠都聚合成团了！！建议你应该稀释细胞，在计数以后再调节细胞的浓度！！
细胞冻存浓度在5－6M/ml!!
插管是个技术活，但是熟能生巧。我建议你用一下：医用硅胶管，最小号的那种，直接插入（前端可剪成一小斜面，尖端再剪圆），这样不会损伤血管，也好用线扎紧。
灌流：两步法。具体同上战友所述。此外，可在膈肌处找到一根很粗的下腔静脉，利用它可以做一个灌流循环！（胶原酶太贵了：））。整套体系可在水浴控温条件下进行。
消化时间：可以明显看到肝脏变白、变软，呈现蜂窝状，即可。把粘膜撕开，小镊子轻轻一刮，细胞就掉下来了。
细胞大小：我当时用10*10就可以看到，不知道你的为什么会那么小。
插管是个技术活，一般非外科医生很难掌握，我们用的是离体分离肝细胞：(30mg/kg)麻醉新生中国实验小型猪。常规方法消毒皮肤，开腹，暴露门静脉并注入肝素钠100～150U。
，于肝门处剪下取出，先用前灌流液(含EDTA、无Ca2+、Mg2+的Hanks液)以80～100ml/min的速度灌流10～15min，％的胶原酶液以50～70ml/min的速度灌流10min。两种灌流液均保持在37～38℃。
，用剪刀划破肝包膜，剔除大块纤维结缔组织，收集细胞悬液，酌情再置37℃条件下消化10～15min。用RPMI-1640培养液终止消化，3层纱布过滤，然后50g、3min离心洗涤肝细胞3～4次，获得肝细胞。
最近在分离原代肝细胞，用的是两步灌流法，就是先用灌流液，后用胶原酶灌流消化，然后用200目筛网过滤，50g离心3min，之后用PBS洗3次，也是上面的转速和时间，得到下层的肝细胞，用培养液悬浮，接到6孔板里，然后就有浑浊的沉淀，沉淀是肝细胞，4个小时之后换液，原代肝细胞很容易贴壁生长，4小时肯定能贴壁，将此沉淀用培养液或pbs稀释，加台盘蓝染色，显微镜下观察，若为活细胞，通常就是肝细胞了，要培养好，最好有大于85%以上的活性。（原代肝细胞最好生长在鼠尾胶原上，也就是用鼠尾胶原铺板，然后再普细胞。）4小时后换液，然后每20小时左右换液，通常原代肝细胞难以增值，但是维持20天左右没问题。
养原代小老鼠肝细胞
肝实质由大量肝细胞为主组成,含间质量少,采用肝脏原位灌注消化法，从门静脉或其分支插管，用无钙缓冲液冲洗肝脏
15min以清除血液和钙离子，然后用胶原酶液灌注15min，纤维组织网即被消化，其具体步骤如下:
1、在38—39度的水浴槽中预热Hepes缓冲液和胶原酶液，使其在肝内达到37度。
2、给小鼠腹腔注射巴比妥钠（100uL/100g)，从股静脉注射肝素（1000IU）。
3、打开腹腔，在门静脉的肝外5mm处松松地放置一个结扎线环，将血管套管插入到肝脏，结扎。
4、快速切下肝下血管，灌注500ml无钙Hepes缓冲液，流速为30mL/min，数秒钟内肝脏即变白。
5、灌注胶原酶