文档介绍：...页眉....页脚影响 PCR 扩增因素的分析【摘要】聚合酶链反应(PCR) 技术问世以来,已经在生物学研究领域内得到了巨大的发展并不断完善,不仅广泛应用在基础研究领域,在疾病诊断等方面也有了越来越广泛深入的研究和应用。该反应具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点,经过不断改良, PCR 技术已成为分子生物学研究常用的手段。通过阅读大量文献资料,本文对聚合酶链式反应(PCR) 的基本概念、工作原理以及影响其扩增的因素各方面作了概述。【关键词】聚合酶链式反应(PCR) 温度引物 Taq DNA 聚合酶前言: DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA 聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。实验发现,DNA 在高温时发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制 DNA 的变性和复性,并设计引物做启动子,加入 DNA 聚合酶、 dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。聚合酶链式反应(英文全称: Polymerase Chain Reaction ),简称 PCR ,又称无细胞分子克隆或特异性 DNA 序列体外引物定向酶促扩增技术。是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法, 其最基本的 3 个环节是:①DNA 变性:双链 DNA 模板在热作用下,氢键断裂,形成单链 DNA 。②退火(复性):系统温度降低,引物与 DNA 模板结合,形成局部双链。③延伸:在Taq 酶(在72 ℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP 为原料,从引物的 5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA 链。由以上三个环节组成一个周期,循环进行,每一循环,DNA 含量增加一倍,此方法操作简便快速,并且非常有效,可在很短的时间内得到数百万个特异DNA 序列的拷贝。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有 DNA ,RNA 的地方。目前为止,PCR 技术已有十几种之多,如将 PCR 与反转录酶结合,成为反转录 PCR ,将 PCR 与抗体等相结合就成为免疫 PCR 等。 DNA ,首先要设计两条寡核苷酸引物,所谓引物,实际上就是两...页眉....页脚段与待扩增靶 DNA 序列互补的寡核苷酸片段,两引物间距离决定扩增片段的长度,两引物的 5’端决定扩增产物的两个 5’末端位置。由此可见,引物是决定 PCR 扩增片段长度、位置和结果的关键,引物设计也就更为重要。设计引物应遵循以下原则: ①引物长度根据统计学计算,长约 17 个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为 1次。因此,引物长度一般最低不少于 16个核苷酸,而最高不超过 30个核苷酸,最佳长度为 20~24个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度(通过 72℃)下不会形成稳定的杂合体。有时可在 5’端添加不与模板互补的序列,如限制性酶切位点或启动因子等,以完成基因克隆和其他特殊需要;引物 5’端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。②引物扩增跨度以200-500bp 为宜,特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。③引物碱基引物的组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中( G+C )% 含量应尽量相似,在已知扩增片段(G+