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影响PCR扩增因素的分析
[摘要]:PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。DNA合成酵素最早于1955年发现 (DNA polymerase I), 而较具有实验价值与可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现, 但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素, 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。随着经济的全球化，PCR技术的广泛应用，研究PCR技术的影响因素闲的愈来愈重要。
[关键词]: 多聚酶链式反应 PCR扩增技术多重PCR
1．PCR技术的原理
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍[1]。
聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction，PCR)，又称无细胞克隆技术
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(FreeBacteria Cloning Technique)，是一种根椐生物体内DNA复制的某些特点而设计的，在体外对特定DNA序列进行快速扩增的技术。
2．PCR技术的发展
常规PCR检测
对细菌进行分类鉴定的常规PCR技术，主要是以高度保守的特定基因序列的基础上建立起来的，如核糖体RNA(rDNA)、gyrB基因、toxR基因等。自6O年代末，Woese首次运用rDNA分析生物的系统发育以来，rDNA数据库快速扩大，已成为细菌多样性、系统进化与发育研究广泛采用的序列。细菌的16SrDNA基因核苷酸序列具有高度保守性，它的序列变化与进化距离相适应，被称为一种进化分子钟。由于其进化速度大约是每五千万年发生1％的碱基变化，所以适用于种以上水平的鉴定。研究细菌16SrDNA最直接的方式就是通过基因测序并与Genbank、EMBL、DDB等国际通用的数据库比对，根据同源性的大小确定细菌种的归类。23SrDNA基因也是非常保守的序列，由于它与16SrDNA基因是线性串联排列，在此基础上就发展出利用16S-23SrDNA基因间区序列来对细菌进行鉴定的方法。这个基因区段的进化速度高于16S rDNA，因此可以发展成为细菌种甚至株的鉴定方法。除此以外，还有其它一些高度保守的序列，如gyrB基因(细菌中广泛存在的一种编码DNA的拓扑异构酶Ⅱ的B亚基的单拷贝基因)、toxR基因(弧菌中的***表达调控蛋白基因)等也越来越广泛的被用于对病原性细菌进行分子生物学鉴定。
多重PCR技术
多重PC