文档介绍：2021年DNA提取及PCR扩增实验报告
2021年DNA提取及PCR扩增实验报告
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2021年DNA提取及PCR扩增实验报告
PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳
刘琳 1131428 环境科学
一、 试验目
1．学****并掌握PCR扩增基础原理与试验技术。
2．对扩增后DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验, 并分析对应结果。
二、 试验原理
1. PCR扩增
多聚酶链反应（PCR）技术原理类似于DNA天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液, 加入微量模板DNA、 四种脱氧核苷酸（dNTP）、 耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物, 以后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性, 双链解链, 这是所谓变性阶段。降低溶液温度, 使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链, 这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃）, 在Tap酶作用下, 用四种dNTP为原料, 引物为复制起点, 模板DNA一条双链在解链和退火以后延伸为两条双链, 这是延伸阶段。如此反复, 在同一反应体系中可反复高温变性、 低温退火和DNA合成这一循环, 使产物DNA反复合成, 并在反复过程中, 前一循环产物DNA可作为后一循环模板DNA而参与DNA合成, 使产物DNA量按指数方法扩增。经过30～40个循环, DNA扩增即可完成。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳试验
DNA分子在高于其等电点溶液中带负电, 在电场中向阳极移动。在一定电场强度下, DNA分子迁移速度取决于分子筛效应, 即分子本身大小和构型是关键影响原因。DNA分子迁移速度与其相对分子量成反比。不一样构型DNA分子迁移速度不一样。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物, 利用DNA分子在泳动时电荷效应和分子筛效应, 达成分离混合物目。
三、 试验材料
仪器: PCR扩增仪、 、 、 移液枪、 枪头、 微波炉、 电泳仪、 水平电泳槽、 制胶版、 紫外透射仪。
试剂: TapDNA聚合酶、 dNTP、 buffer、 两种引物、 16S全长DNA样本、 无菌ddH2O、 模板DNA 、 TBE、 琼脂糖、 EB、 显色剂。
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试验步骤
1. PCR扩增
此次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。
依据计算, 10×Buffer 、 1 ul dNTP、 ul 341GC、 ul 534、 ul Taq、 ddH2O百分比配置足量PCR反应体系。
分别向9个薄壁管中分别加入24 ul反应体系, 并分别添加8种不一样模版, 并于第9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。
将薄壁管放入PCR扩增仪中, 根据预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达成30~40次。程序以下:
预变性: 94℃ 3min
循环: 94℃ 变性30s
55℃ 退火30s
72℃ 延伸30s
末次延伸: 72℃ 5m