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第一章 基因工程
第一节 基因工程概述
一．基因工程的概念
操作环境
操作对象
操作水平
根本过程
结果
生物体外
基因
分子水平
剪切→拼接→导入→表达
人类需要的基因产物
由于基因工程是在DNA分子水平上进展操作,因此又叫做重组DNA技术。
二．基因工程的根本工具
〔一〕"分子手术刀〞——限制性核酸切酶〔简称限制酶〕
1．来源：主要是从原核生物中别离纯化出来的。
2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两
个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3．结果：经限制酶切割产生的DN***段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
〔二〕"分子针线〞——DNA连接酶
1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类
2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比拟：
①一样点：都缝合磷酸二酯键
②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；
T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。
★DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比拟
DNA连接酶
DNA聚合酶
不同点
连接的DNA
双链
单链
模板
不要模板
要模板
连接的对象
2个DN***段
单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DN***段上
一样点
作用实质
形成磷酸二酯键
化学本质
蛋白质
(三)"分子运输车〞——载体
：
①能在受体细胞中复制并稳定保存；
②具有一至多个限制酶切割位点，供外源DN***段插入；
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
：质粒、噬菌体和动、植物病毒等。
最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。
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三．基因工程的根本过程
(一) 获得目的基因〔目的基因的获取〕
：①从自然界中已有的物种中别离出来，如可从基因文库中获取。
②用人工的方法合成。
★获得原核细胞的目的基因可采取直接别离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。
★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。
〔1〕PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DN***段的核酸合成技术。
〔2〕目的：获取大量的目的基因
〔3〕原理：DNA双链复制
〔4〕过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链；
第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；
第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进展互补链的合成。
〔5〕特点：指数形式扩增
(二) 制备重组DNA分子〔基因表达载体的构建〕
1．重组DNA分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因。
★标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
2．方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。
(三) 转化受体细胞〔将目的基因导入受体细胞〕
：是目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞维持稳定和表达的过程。
：
①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术〔农杆菌转化法〕，其次还有基因枪介导转化技术〔基因枪法〕和花粉管通道技术〔花粉管通道法〕。
②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。
③将目的基因导入微生物细胞：Ca＋处理法。
(四) 筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达〔目的基因的检测与鉴定〕
，方法是采用DNA分子杂交技术。