文档介绍：酶活米氏常数实验一、实验前准备 1、 24 孔板洗净烘干,准备足够枪头。 2 、准备催化剂,在光下呈透明状为分散性较好,否则用超声清洗器(位于化学间)超声分散 5min , 期间准备底物(如 TMB 或者 ABTS ), 浓度依照自己实验的要求定( 10mg/m L 或 5mg/mL ) ,一般 1mL 足够用,可在 离心管中溶解。 TMB (外间冰箱上层)溶于 DMSO ( 二甲亚砜, 位于化学间王春雨的柜子里), ABTS (与 TMB 放在一起) 溶于二次水。 3、将缓冲液、催化剂、底物、H 2O 2、 200 μL和 10μL 移液枪、 50μL 排枪( 位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中)、 96 孔板、 24 孔板、卷纸一起放入纸盒中,放到对面酶标仪前, 开空调定室温( 25℃, 提醒其他人随手关门), 24 孔板中其中一排加入适量 H 2O 2( 每孔 1m L 左右, 注意避光, 可在板上盖一张卷纸), 将缓冲液、催化剂、底物放实验台上, 静置 -1h 。 4 、记录本上提前写好实验的加样顺序: 催化底物 TMB (或 ABTS )的酶促动力学过程加样顺序: ① 200 μL 缓冲液② 10μL催化剂③底物 TMB ( ABTS ) (0, ,1,2,4,6,8, 10μ L)④ 32μ LH 2O 2 (排枪加) 催化底物 H2O2 的酶促动力学过程加样顺序: ① 200 μL 缓冲液② 10μL 催化剂③H 2O 2 (2,4,6,8, 10, 16, 32, 64μL)④ 10μL 底物 TMB ( ABTS ) (排枪加) 数据记录按下表记, Code 为每次读板时的微孔板编号, Time 为对应的读板时的时间, 一般 30s 读板一次,可根据反应的快慢来确定读板的时间。 C ode 1234567 T ime TMB 0 12468 10 V 01 C ode 1234567 T ime H 2O 22468 10 16 32 64 V 01 二、实验 1 、打开酶标仪(开关在仪器后部,若仪器没反应,请检查电源是否接通) ,密码为 5个 0 ,按 Enter 键进入系统。电脑开机,密码为 mby-nano ,双击酶标仪软件图标,出现登录框,直接点击“登录”,进入酶标仪控制界面, 若底物为 TMB , 选择“铁动力学”( 波长为 650nm) ,选择模板1 ; 打 开电脑内置时钟, 若底物为 ABTS , 则检验项目选择“ gg”( 波长为 405nm ) 。新建一个 word 文档,以日期命名,打开。 2 、加样: 96 孔板从左至右编号为 1-12 ,自上而下编号为 A-H 。以 TMB 为例,从第 1 列加样: ①从 A1 至 H1 ,每孔加 200 μL NaAc/HAc Buf ; ②从 A1 至 H1 , 每孔加 10μL 催化剂( 每加一个孔, 换一次枪头, 加样时用枪头搅匀反应体系); ③从 A1 至 H1 , 每孔分别加不同体积(0, ,1,2,4,6,8, 10μL) TMB ( 每加一个孔,换一次枪头,加样时用枪头搅匀反应体系); ④用排枪吸取 32μLH 2O 2 加入 A1 至 H1 , 快速放入酶标仪中, 点击“读板”, 记下读板时间(如下表所示,假设第一次读板时间为 09: 00: 00) C ode 1234567 T ime 00: 00 00: 30 01: 00 01: 30 02: 00 02: 30 03: 00 03: 30 TMB 0 12468 10 V 01 用排枪加 H 2O 2 时, 注意检查枪头是否插紧,否则会导致吸取 H 2O 2 的量不足。亦可先将 96 孔板放入酶标仪, 再加 H 2O 2, 这样可以节约时间。每次读板出来结果后, 点击“结果入库”——>“是”——>“确定”, 按下“ PrintScreen ”键, 点击“退出”, 打开 word 文档, ctrl+V 或者右击选“粘贴”, 保存结果, 要留意下次读板的时间。若遗漏某个模板没有保存, 可点击“查询结果”,下拉框中选择目的模板编号即可。( 现已可以直接拷吸光值读取数据, 按 ctrl 键点击该处文字见方法)3、第一组数据保存后, 将第一组的反应液倒掉, 用卷纸将边上的液体擦干。第二、三、四组同第一组的操作。保存所有数据,拷贝到 U 盘里,整理实验台,关掉酶标仪、空调和电脑。 4、若当天不再继续实验,将 24 孔板中剩余的 H 2O 2 倒掉, 用清洁剂洗后, 再用二次水冲洗一次,放入烘箱中烘干。移液枪放回原处,催化剂、底物和 H 2O 2 放入冰箱中保存。三、数据处理 1 、打开 ,点击右上角的“ Add N